TTC Окрашивание срезов мозговой ткани крысы: процедура окрашивания для дифференциации жизнеспособной и некротической ткани в срезах тканей после ишемии-реперфузионного повреждения

Во время ишемии мозга нарушение притока крови к мозгу снижает поступление кислорода и питательных веществ к тканям, вызывая повреждение мозга. После кратковременной ишемии, когда приток крови к мозгу восстанавливается, реперфузия с повышенным снабжением кислородом приводит к перепроизводству активных ионов, что приводит к окислительному повреждению тканей, известному как ишемия-реперфузионное повреждение.

Чтобы оценить повреждение головного мозга после ишемии-реперфузионного повреждения на модели крысы, сначала собирают мозг крысы. Промойте в охлажденном буфере, чтобы удалить мусор и кровь. Разрез мозга для получения корональных срезов желаемой толщины. Осторожно переложите ломтики в буферный лоток - передними поверхностями вверх - для последующего окрашивания.

Добавьте раствор теплого трифенилтетразолия хлорида, ТТС, водорастворимого окислительно-восстановительного красителя, на срезы мозга. Инкубируйте в темных условиях, так как TTC светочувствительна. ТТС проникает в клетки внутри тканевого участка.

В живых клетках активный фермент митохондриальный сукцинатдегидрогеназа в присутствии кофакторов восстанавливает бесцветный при окислении TTC до нерастворимого в воде красного цвета, окрашивая жизнеспособные клетки в темно-красный цвет. Однако у некротических клеток отсутствует активность дегидрогеназы; Таким образом, ТТС остается в окисленной форме, окрашивая клетки в белый цвет.

После инкубации перенесите срезы мозга в лоток для визуализации. Разделяют полушария в сагиттальной плоскости. Представьте себе срезы мозга.

Здоровая ткань выглядит красной, в то время как поврежденная ткань выглядит белой, что отличает некротизированную ткань от жизнеспособной и позволяет оценить степень повреждения ткани.

После удаления мозга, включая ствол мозга, из черепа, поместите мозг вентральной стороной вверх в матрикс мозга. В зависимости от веса животных, правильно выбирают размер мозга из нержавеющей стали. С помощью лезвий ограничьте лобный и каудальный отделы мозга. Затем поместите лопасти частично в каналы между первой и последней лопастями.

Когда все лезвия вставлены и расположены параллельно, прижмите все лезвия ладонью одновременно, чтобы разрезать мозг на 2-миллиметровые корональные срезы. Затем крепко возьмитесь за лезвия по бокам двумя пальцами и извлеките их вместе со срезанным мозгом из матрицы. Разложите срезы мозга один за другим в лотке, следя за тем, чтобы передняя поверхность каждого среза всегда была обращена вверх.

Далее налейте на срезы мозга теплый 1% раствор трифенилтетразолия хлорида и PBS, и выдержите 8 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. После инкубации переложите срезы мозга в синий пластиковый лоток для получения изображений. Расположите срезы мозга в последовательном порядке от лобной к каудальной части, а с помощью скальпеля разделите полушария в сагиттальной плоскости.