Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой: метод in vitro для обнаружения культивируемых остеокластов, содержащих фермент TRAP

Остеокласты — это большие, куполообразные, многоядерные клетки, обнаруженные на поверхности кости. Эти клетки содержат многочисленные цитоплазматические гранулы, богатые тартрат-резистентной кислой фосфатазой, или TRAP – металлопротеиновым ферментом, секретируемым из взъерошенной границы остеокластов в костную ткань. Этот фермент переваривает внеклеточный матрикс и растворяет минеральные кристаллы, способствуя резорбции костей.

Чтобы обнаружить гранулы TRAP в качестве цитохимических маркеров остеокластов, возьмите чашку для посева, содержащую адгезивные остеокласты. Добавьте в ячейки раствор для окрашивания TRAP. Этот раствор содержит субстрат - фосфатсодержащее производное нафтола и винную кислоту в буфере с добавлением соли диазония.

Добавьте уксусную кислоту в этот раствор для поддержания кислотного pH, необходимого для окрашивания TRAP. Инкубируйте клетки в темноте при физиологической температуре для оптимальной активности фермента TRAP.

Окрашивающий раствор поступает в остеокласты, где винная кислота подавляет гидролизующую активность тартрат-чувствительных кислых фосфатаз в других клетках.

В то же время TRAP гидролизует добавленный субстрат для удаления его фосфатной группы. Гидролизованный субстрат соединяется с солью диазония из окрашивающего раствора, образуя нерастворимый комплекс красителей темно-бордового цвета. Этот комплекс выпадает в осадок в виде гранул на участках ферментативной активности.

Визуализируйте клетки под микроскопом. Осаждение гранул краителя темно-бордового цвета внутри цитоплазмы подтверждает наличие в культуре TRAP-содержащих остеокластов.

На этом этапе аспирируйте среду и аккуратно промойте образец три раза с помощью 1X PBS. Далее зафиксируйте ячейки в каждой лунке 96-луночного планшета 100 микролитрами раствора фиксатора на 30 секунд при комнатной температуре.

После фиксации аспирируйте раствор и аккуратно трижды промойте клетки деионизированной водой, предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия. Затем аспирируйте деионизированную воду и добавьте по 100 микролитров красителя TRAP в каждую лунку 96-луночного планшета.

Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут и защитите от света. После окрашивания аспирируйте пятно TRAP и аккуратно трижды промойте деионизированной водой. Затем визуализируйте остеокласты в инвертированном микроскопе с 40-кратным увеличением.