Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой: метод in vitro для обнаружения культивируемых остеокластов, содержащих фермент TRAP

Остеокласты — это большие, куполообразные, многоядерные клетки, обнаруженные на поверхности кости. Эти клетки содержат многочисленные цитоплазматические гранулы, богатые тартрат-резистентной кислой фосфатазой, или TRAP – металлопротеиновым ферментом, секретируемым из взъерошенной границы остеокластов в костную ткань. Этот фермент переваривает внеклеточный матрикс и растворяет минеральные кристаллы, способствуя резорбции костей.

Чтобы обнаружить гранулы TRAP в качестве цитохимических маркеров остеокластов, возьмите чашку для посева, содержащую адгезивные остеокласты. Добавьте в ячейки раствор для окрашивания TRAP. Этот раствор содержит субстрат - фосфатсодержащее производное нафтола и винную кислоту в буфере с добавлением соли диазония.

Добавьте уксусную кислоту в этот раствор для поддержания кислотного pH, необходимого для окрашивания TRAP. Инкубируйте клетки в темноте при физиологической температуре для оптимальной активности фермента TRAP.

Окрашивающий раствор поступает в остеокласты, где винная кислота подавляет гидролизующую активность тартрат-чувствительных кислых фосфатаз в других клетках.

В то же время TRAP гидролизует добавленный субстрат для удаления его фосфатной группы.