Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:15 мин. • July 8th, 2025
Сульфатированные гликозаминогликаны, ГАГ, представляют собой длинные, отрицательно заряженные, линейные полисахариды с повторяющимися цепочками дисахаридных звеньев, сульфатированными в различных положениях, существующими различной длины.
Чтобы визуализировать интересующие нас изолированные сульфатированные ГАГ, различающиеся по длине цепи в полиакриламидном геле после электрофореза, осторожно извлеките гель из кассеты. Промойте деионизированной водой, удаляя прикрепленные кусочки геля, которые могут помешать окрашиванию.
Обработайте кислым раствором альцианского синего. В кислых условиях Alcian blue, поливалентный катионный краситель с атомом меди в центре, специфически взаимодействует с отрицательно заряженными сульфатированными GAG посредством ионных взаимодействий, образуя темно-синий нерастворимый в воде комплекс.
Смойте гель деионизированной водой и метанолом, удалив остатки пятна. Инкубируйте гель с раствором щелочной селитры серебра. В щелочных условиях сульфатированные ГАГ в связывании с алкийским синим обеспечивают участки для связывания и образования комплекса положительно заряженных ионов серебра.
Обработайте гель в развивающем растворе, содержащем формальдегид и лимонную кислоту. Лимонная кислота снижает локальный pH для оптимальной активности формальдегида, который восстанавливает ионы серебра до нерастворимого металлического серебра в сульфатированных фрагментах GAG, усиливая сигнал алкийского синего.
Добавьте стоп-раствор для снижения pH, предотвращая уменьшение ионов серебра для минимального фонового окрашивания. Теперь представьте себе гель.
Полосы сульфатированных фрагментов GAG, окрашенные в сине-серебристый цвет, выглядят темно-коричневыми или черными, что позволяет с высокой чувствительностью визуализировать и определять длину изолированной полимерной цепи GAG.
Как только прогон будет завершен, разберите кассету и осторожно извлеките гель в большую чистую емкость, наполненную деионизированной, отфильтрованной водой. Затем слейте воду и смочите гель в растворе для окрашивания альцианским синим в течение пяти минут. Выбросьте пятно от алкийского синего цвета и быстро промойте два-три раза деионизированной, отфильтрованной водой, пока большая часть раствора для окрашивания алкийского синего цвета не будет удалена.
Окрасьте гель в раствор для окрашивания нитрата серебра в свежую чистую емкость на 30 минут. Затем постирайте два-три раза по 30 минут каждый в деионизированной фильтрованной воде, чтобы полностью удалить раствор для окрашивания серебра. Слейте воду и добавьте развивающий раствор.
Внимательно следите за гелем на предмет появления полос. В зависимости от качества окрашивания и массы загруженного образца, проявление может занять от нескольких секунд до нескольких минут. Как только будут видны нужные полосы, сразу же выбросьте проявляющий раствор, и кратковременно смойте гель стоп-раствором.