Окрашивание по Гимзе для анализа на образование колоний: процедура окрашивания in vitro для оценки пролиферативной способности мезенхимальных стволовых клеток
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 2:52 мин • July 8th, 2025
Анализы на образование колоний измеряют пролиферативную способность клеток к росту в колонии.
Во-первых, суспензию клеток, полученных из костного мозга, содержащую эритроциты и мононуклеарные клетки, включая мезенхимальные стволовые клетки или МСК, в среде на культуральном планшете и в инкубаторе. МСК, прилипают к дну пластины, в то время как эритроциты и мононуклеарные клетки остаются во взвешенном состоянии и отбрасываются
от них.Добавьте свежие среды, содержащие факторы роста для поддержания выживаемости МСК. В зависимости от их индивидуального пролиферативного потенциала, МСК реплицируются с образованием колоний.
Далее обработайте колонии метанолом. Метанол проникает в клетки, вытесняет воду из внутриклеточной среды и денатурирует белки, сохраняя клеточную архитектуру.
Инкубируют неподвижные колонии с окрашивающим раствором Гимзы - смесью продуктов окисления метиленового синего, в первую очередь лазурного В, основного красителя, и эозина Y, кислотного красителя. При диффузии в клетки положительно заряженные лазурные димеры B связываются посредством интеркаляции с отрицательно заряженной ДНК в ядре, придавая ей синий оттенок.
Затем отрицательно заряженные мономера эозина Y взаимодействуют с ненейтрализованными положительными зарядами на связанных димерах лазурного B, образуя «комплекс эозин-Y-лазурный-B», изменяя окраску окрашенной в синий цвет ДНК на фиолетовый.
В цитоплазме, богатой рибосомами, лазурь B связывается с отрицательно заряженной РНК, но сниженное проникновение эозина Y в высокоплотные рибосомы препятствует образованию комплекса эозин-Y-лазурный-B, окрашивая РНК в синий цвет.
Теперь вымойте пластину с буфером, чтобы удалить лишнее пятно, и высушите на воздухе. Подсчитайте количество колоний, которые проявляются в виде скоплений клеток с фиолетовыми ядрами и синей цитоплазмой.
Чтобы провести анализ на КОЕ, приготовьте 10 миллилитров раствора Гимзы на одну посуду, разбавив исходный раствор стерильной водой в соотношении 1 к 10. Удалите среду из чашки для клеточной культуры и используйте PBS для тщательной промывки клеток.
С чистым метанолом зафиксируйте ячейки при комнатной температуре в течение 5 минут, затем выбросьте метанол и добавьте раствор Гимзы. Выдерживать во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. После инкубации используйте PBS для промывания клеток дважды. Затем высушите тарелку на воздухе головой вперед на бумажном полотенце. С помощью маркера на обратной стороне таблички вручную подсчитайте колонии.
Обзор
В данной статье описывается метод анализа колониеобразования — способ оценки пролиферативной способности клеток костного мозга, в частности мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Процесс включает посев клеточных суспензий, инкубацию и применение метода окрашивания для визуализации образовавшихся колоний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Исследования стволовых клеток
- Разработка методов анализа
Теоретические сведения
- Методы анализа формирования колоний имеют важное значение для оценки пролиферации клеток.
- МСК известны своей способностью к дифференцировке и пролиферации.
- Методы окрашивания помогают визуализировать клеточные структуры и оценить жизнеспособность.
- Понимание поведения МСК имеет решающее значение для терапевтического применения.
Цель исследования
- Продемонстрировать методику проведения анализа колониеобразующей способности.
- Подчеркнуть значимость МСК в регенеративной медицине.
- Предоставить детальный протокол для воспроизведения исследователями.
Используемые методы
- Посев суспензии клеток костного мозга на культуральные планшеты.
- Инкубация для обеспечения адгезии МСК и формирования колоний.
- Фиксация колоний метанолом для их сохранения.
- Окрашивание раствором Гимзы для визуализации колоний.
Основные результаты
- Успешное образование колоний наблюдается в виде скоплений клеток.
- Окрашивание позволило дифференцировать ДНК и РНК внутри клеток.
- Протокол обеспечивает точный подсчет колоний.
- Визуальные результаты демонстрируют эффективность анализа.
Выводы
- Метод анализа формирования колоний является надежным способом оценки пролиферации МСК.
- Методы окрашивания улучшают визуализацию клеточных структур.
- Данный метод может быть использован в различных областях исследований стволовых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная оценка пролиферативной способности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) имеет решающее значение для валидации мишеней на ранних стадиях и снижения рисков при разработке препаратов для клеточной терапии и регенеративной медицины. Анализ формирования колоний с окрашиванием по Гимзе обеспечивает стандартизированный и воспроизводимый результат для оценки жизнеспособности и экспансивного потенциала МСК, что повышает прогностическую достоверность при отборе доклинических кандидатов. Данный рабочий процесс позволяет проводить надежное сравнение популяций клеток и принимать обоснованные с учетом рисков решения о продвижении проектов в рамках портфелей фундаментальных и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую измерить пролиферативный потенциал МСК для функциональной валидации мишеней.
- Способствует снижению биологических рисков путем дифференциации жизнеспособных колониеобразующих клеток от непролиферирующих популяций.
- Повышает прогностическую достоверность гипотез о терапии на основе клеток и упрощает сортировку портфеля проектов.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать валидированный количественный метод анализа колониеобразования МСК, подходящий для последующих этапов скрининга.
- Обеспечивает воспроизводимые стандартизированные результаты для сравнения различных условий и партий.
- Позволяет надежно оценивать влияние соединений или условий на пролиферацию МСК.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает переход от открытий in vitro к выбору доклинической модели путем количественной оценки экспансивного потенциала MSCs.
- Поддерживает трансляционную преемственность путем сопоставления показателей пролиферации in vitro с потенциалом приживления in vivo в соответствующих случаях.
- Снижает механистическую неопределенность при отборе кандидатов для клеточной терапии.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод анализа колониеобразования с окрашиванием по Гимзе занимает промежуточное положение между этапом первичного поиска и доклиническими исследованиями, позволяя проводить проверку гипотез и функциональную валидацию MSC до идентификации ведущих соединений или проведения трансляционных исследований.
- Открывающая биология: позволяет количественно оценить пролиферацию МСК для проверки гипотез и уточнения путей передачи сигналов.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированный и воспроизводимый подсчет колоний для подтверждения готовности анализа и сравнения партий.
- Аналитика: генерирует количественные данные для статистического анализа различий в пролиферации при различных условиях.
- Трансляционные исследования: помогают в выборе доклинических моделей, связывая пролиферацию in vitro с потенциальной эффективностью in vivo.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многоразовую масштабируемую платформу для анализа в рамках текущих программ исследований и разработок в области МСК.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях на основе МСК.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые результаты анализа для использования различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки, а также эффективно управлять портфелем проектов с точки зрения затрат капитала.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение кандидатов для клеточной терапии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с протоколами культивирования клеток, фиксации и окрашивания.
- Необходим доступ к стандартной инфраструктуре для культивирования тканей и аналитической микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация подсчета колоний и интерпретации данных.
- Может потребоваться адаптация для различных источников MSC или модельных систем.
- Ручной подсчет колоний может ограничить пропускную способность и привести к вариативности результатов в зависимости от оператора.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека
Похожие видео
0 Просмотры
Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse
Похожие видео
0 Просмотры
Межфазная флуоресценция in situ Гибридизация мазков костного мозга множественной миеломы
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)
Похожие видео
0 Просмотры
Колония Формирование Cell (CFC) Пробирной по правам гемопоэтических клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников
Похожие видео
0 Просмотры
Характеристика генетически модифицированных мезенхимальных стволовых клеток для применения в нейротерапии
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение мезенхимальных стволовых клеток человека и их культивировании на пористых Bone Matrix
Похожие видео
0 Просмотры
Ферментативный метод для того чтобы спасти мезенхимальных стволовых клеток из запекшейся образцы костного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Оценка иммуномодулирующими свойствами человеческой мезенхимальных стволовых клеток (МСК)
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026