Окрашивание альцианским синим для визуализации протеогликанов: метод обнаружения протеогликанов в культуре дифференцированных хондроцитов мезенхимальных стволовых клеток in vitro

Протеогликаны состоят из основного белка, ковалентно присоединенного к сульфатированным гликозаминогликановым цепям.

Чтобы визуализировать протеогликаны, начните с основанных на коллагене скаффолдов — пористого полимерного субстрата — и засейте на них суспензию мезенхимальных стволовых клеток, или МСК. Это обеспечивает структурную поддержку МСК и позволяет им расти как на поверхности, так и внутри полостей каркасов.

Обрабатывайте конструкции в среде хондрогенной дифференцировки, содержащей трансформирующие факторы роста, которые стимулируют трансформацию МСК в зрелые хондроциты - хрящевые клетки. Зрелые хондроциты выделяют протеогликаны, которые образуют сеть с коллагеном в каркасе.

Возьмите срез, приготовленный из конструкции, насыщенной хондроцитами. Добавьте кислый раствор красителя альцианской синевы, дополненный гидрохлоридом гуанидия, и инкубируйте. Во время инкубации гидрохлорид гуанидина в растворе красителя диссоциирует любые агрегаты протеогликанов для лучшего окрашивания.

Впоследствии отрицательно заряженные сульфатированные гликозаминогликаны из протеогликанов связываются с содержащими медь положительно заряженными молекулами красителя алкийского синего, что приводит к образованию синих отложений.

Далее погрузите предметное стекло в раствор для задержания, содержащий хлорид магния. Ионы магния конкурируют с положительно заряженными молекулами красителя за места связывания на гликозаминогликанах, тем самым предотвращая чрезмерное окрашивание.

Представьте себе раздел. Синяя окраска подтверждает наличие в образце протеогликанов

Провести хондрогенную дифференцировку с губчатым медицинским прибором, изготовленным из лиофилизированного коллагена 1 типа, нарезать кубиками по 3 миллиметра с каждой стороны. Засейте МСК поверх кубиков в концентрации 4 х 10⁶ клеток/мл.

Дав клеткам прилипнуть к кубикам в течение 30 минут при комнатной температуре, поддерживайте МСК-коллагеновые конструкции в хондрогенной среде, как указано в текстовом протоколе. Добавьте в срезы 0,4% раствор альцианского синего и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день используйте 40% ДМСО и 0,05 молярного хлорида магния для промывания клеток в течение 30 минут, прежде чем использовать ядерный быстрый красный для противостояния клеткам.