JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:14 мин • July 8th, 2025
Активированные стрессом сердечные фибробласты откладывают чрезмерное количество коллагена в поврежденных областях, состояние, называемое фиброзом, которое ухудшает функцию сердца.
Чтобы визуализировать степень фиброза, сначала сделайте срез сердечных блокад, залитых парафином. Поместите секции на слайд. Нагрейте предметное стекло, чтобы расплавить парафин, дав срезам прилипнуть.
Окуните предметное стекло в ксилол, чтобы депарафинизировать ткань. Обработайте срезы убывающей концентрацией спирта, чтобы регидратировать срезы и способствовать последующему связыванию компонентов водного окрашивания.
Инкубируйте участки в кислотном фиксаторе, который сшивает белки, стабилизируя структуру ткани. Промойте водой, чтобы удалить остатки фиксатора.
Погрузите предметное стекло в раствор гематоксилина. Катионный краситель связывается с отрицательно заряженной ДНК, окрашивая ядро в синий цвет. Промойте водой, чтобы удалить излишки пятна.
Инкубируйте предметное стекло в кислоте Fuchsin-Ponceau, низкомолекулярном анионном красителе, который взаимодействует с положительно заряженными цитоплазматическими белками и коллагеном, окрашивая их в красный цвет. Обработайте разведенной уксусной кислотой, чтобы удалить излишки пятна.
Погрузите предметное стекло в раствор фосфомолибдиновой кислоты-Orange G. Оранжевый G, низкомолекулярный краситель, окрашивает эритроциты в оранжево-красный цвет. Фосфомомолибдоновая кислота, высокомолекулярная кислота, вытесняет низкомолекулярные красители из коллагена, делая его бесцветным.
Инкубируйте срезы в светло-зеленом красителе, молекулы которого связывают коллагеновые волокна, окрашивая их в зеленый цвет. Под микроскопом фиброзные участки выглядят зелеными цветами, что указывает на чрезмерное отложение коллагена.
В этой процедуре из парафиновых блоков подготавливают срезы ткани толщиной пять микрон с помощью ручного микротома. Затем окрасьте по одному предметному стеклу с каждой части сердца, для каждой крысы трихромным окрашиванием Массона-Голднера. Для парафиновых срезов расплавьте салфетки при температуре 60 градусов Цельсия в духовке. Под вытяжным шкафом депарафинизируйте их в ксилоле дважды, по 10 минут каждый.
Затем регидратируйте их в 100% этаноле, 95% этаноле, 70% этаноле, а затем дистиллированной воде в течение трех минут каждый. Для депарафинизированных срезов и для криорезов закрепите их в растворе Буина на ночь. На следующее утро промойте их в проточной воде из-под крана в течение 10-15 минут. Затем снова промойте дистиллированной водой.
Фиксация в Буэне является важнейшим этапом для обеспечения великолепного окрашивания по Гольднеру.
Инкубируйте их в гематоксилине Майера в течение трех минут. Через 3 минуты снимите горки, и оставьте их в дистиллированной воде на пять минут. Впоследствии инкубируйте их в Фуксине в Понсо в течение пяти минут, а затем промойте 1% уксусной кислотой в течение одной минуты.
Далее инкубируйте срезы в фосфомолибденовой кислоте Orange G в течение одной минуты, а затем промойте их в 1% уксусной кислоте в течение одной минуты. Выдерживать в светло-зеленом красителе в течение 10 минут, а затем промыть в 1% уксусной кислоте в течение одной минуты. Наконец, обезвожьте срезы в 70% этаноле в течение 30 секунд, 95% этаноле в течение 30 секунд и 100% этаноле в течение пяти минут последовательно. Нанесите одну каплю смолистого монтажного средства на участки ткани, накройте их покровными стеклами и дайте высохнуть.