JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:03 мин • July 8th, 2025
При кофейной ржавчине споры патогенного грибка Hemileia vastatrix попадают на поверхность растения и отращивают прорастающую трубку, тем самым инициируя инфекцию через гифы.
Эти гифы распространяются внутри ткани и проникают в клетки растений через специализированные пальцеобразные структуры, называемые гаусториями, которые поглощают питательные вещества растения. Гаустории также выделяют эффекторные молекулы, которые распознаются белками резистентности растения, что приводит к богатой пектином инкапсуляции гаустории для ограничения инфекции.
Чтобы визуализировать это взаимодействие, начните с ультратонкого, пропитанного смолой, зараженного участка кофейного листа. Теперь обработайте образец лактофеноловым хлопковым синим - гистологическим красителем, содержащим фенол, молочную кислоту, глицерин и хлопковый синий. Слегка нагрейте предметное стекло.
Поскольку компоненты красителя проникают в ткани, фенол уничтожает любые живые организмы, в то время как молочная кислота и глицерин помогают сохранить клеточную архитектуру. В то же время молекулы хлопкового синего связываются с хитиновыми фрагментами в клеточной стенке гриба и окрашивают ее в синий цвет.
Промойте образец дистиллированной водой. Затем обработайте образец красным красителем рутения.
Положительно заряженные молекулы рутения связываются с отрицательно заряженными полисахаридами в богатой пектином клеточной стенке растения и окрашивают ее в красный цвет. Снова промойте предметное стекло и визуализируйте под микроскопом.
Богатая пектином клеточная стенка растения выглядит красной, заключая в себе синюю гаусторию, простирающуюся от синих гиф гриба.
Разрежьте блок на секции толщиной 5 микрометров с помощью вращающегося микротома, оснащенного стальными лезвиями толщиной 8 сантиметров. Поместите секции на стеклянные слайды, покрытые дистиллированной водой, затем перенесите слайды на горячую плиту для сушки при температуре 40 градусов Цельсия и обеспечьте адгезию секций к стеклянным предметным стеклам.
После высыхания пометьте стеклянные предметные стекла ссылочным названием блока и номером предметного стекла. Накройте секции 2 миллилитрами 5% хлопкового синего в лактофеноле, и нагрейте их на горячей плите при температуре 45 градусов Цельсия в течение пяти минут.
Удалите излишки красителя, трижды промыв предметное стекло в стакане, наполненном дистиллированной водой. Окрасьте его 2 миллилитрами 0,01% рутения красного цвета в воде на одну минуту.
Удалите излишки красителя, трижды промыв предметное стекло в стакане, наполненном дистиллированной водой. Капните на срезы каплю дистиллированной воды, а срезы накройте покровным стеклом для проведения светового микроскопического анализа.