Внутривенное окрашивание Судана: процедура окрашивания липид-насыщенных атеросклеротических бляшек в собранной дуге аорты мыши

Атеросклероз возникает из-за накопления липопротеинов во внутренней оболочке артерий, что приводит к накоплению бляшек, утолщению и сужению артерий, снижению кровотока.

Бляшки состоят из фиброзного колпачка с гладкомышечными клетками и внеклеточным матриксом, заключающим в себе ядро, состоящее из липопротеидов низкой плотности, ЛПНП - сферических частиц с гидрофобным ядром из эфиров холестерина и триглицеридов, окруженного фосфолипидным наружным слоем - вместе с воспалительными клетками.

Чтобы визуализировать богатые липидами атеросклеротические бляшки, возьмите свежесобранную дугу аорты мыши. Перенесите ее на темный фон для улучшения контраста во время широкомасштабной визуализации. Добавьте буфер для предотвращения обезвоживания тканей.

Удалите периваскулярную жировую ткань, окружающую дугу аорты, чтобы предотвратить окрашивание ложного фона. Надрежьте аорту и ее ветви в продольном направлении через просвет, чтобы обнажить самую внутреннюю поверхность с накоплением атеросклеротических бляшек.

Закрепите открытую дугу аорты на платформе и инкубируйте в этаноле. Этанол вытесняет воду из тканей, инактивируя белки и сохраняя тканевую архитектуру.

Обрабатывайте суданским внутривенным растворителем краску, растворенную в органических растворителях. Внутри бляшки Sudan IV, жирорастворимый диазокраситель, обладающий высоким сродством к триглицеридам и эфирам холестерина липопротеинов, переходит из фазы органического растворителя и связывается с гидрофобным ядром липидов ЛПНП, образуя стабильные комплексы. Смойте излишки пятна с помощью этанола.

Под стереомикроскопом окрашенные богатые липидами атеросклеротические бляшки выглядят оранжево-красными, в то время как участки без бляшек выглядят бледными.

Чтобы подготовить ложе для прикалывания к анализу лица, сложите сегмент парафиновой пленки в 8 раз, чтобы получилась плоская поверхность размером 25 х 25 миллиметров, и оберните вокруг пленки черную электрическую изоляционную ленту, чтобы получился темный фон для аорты.

Поместите этикетку на заднюю сторону стола для прикалывания и с помощью графитного карандаша запишите идентификационный номер мыши. Перенесите дугу аорты на ложе для штырьвания, и добавьте в ткани каплю PBS. С помощью стереомикроскопа очистите аорту от оставшейся периадвентициальной жировой ткани и с помощью ножниц Vannas и щипцов Дюмона аккуратно удалите всю окружающую жировую ткань, не манипулируя и не повреждая аорту.

Далее введите ножницы Vannas в просвет аорты, чтобы обнажить интимную поверхность. Начните разрез наружной кривизны восходящей дуги в дистальном направлении, продолжая вскрывать ветви, включая брахиоцефальную артерию, и щадя дорсальную часть нисходящей грудной области.

Чтобы показать интимную поверхность, разрежьте меньшую кривизну и согните аорту. С помощью микроиглодержателя Castroviejo закрепите открытую арку на ложе для прикалывания тупым концом мельчайших булавок от насекомых, не растягивая образец, осторожно отгибая булавки от образца, пока ткань удерживается на месте. Затем храните прикрепленную арку лицевой стороной вниз в чашке Петри PBS при температуре 4 градуса Цельсия.

Для окрашивания Sudan IV промойте образец в течение 5 минут в чашке Петри из 70% этанола дугой вниз, прежде чем перенести образец в чашку с рабочим раствором Sudan IV на 7 минут.

В конце инкубации промойте образец двумя 3-минутными промывками в 80% этаноле, чтобы удалить пятна с нормальной интимной поверхности, после чего прополощите ткань в PBS, прежде чем вернуть ткань в исходную чашку Петри. Затем получите микрофотографии под стереомикроскопом, подключенным к цифровой камере с 10-кратным увеличением, получая изображения прикрепленной арки, погруженной в PBS, используя небольшие металлические грузы для удержания прикалывающего слоя к дну чашки Петри.