Окрашивание маулы на лигнин: методика определения характеристик распределения лигнина в срезах стеблей Arabidopsis Thaliana

Лигнин является важным структурным компонентом в клеточной стенке растения. Это полимер, состоящий в основном из сирингиловых спиртов, или S-лигниновых звеньев, и гваиациловых спиртов, или G-лигниновых звеньев, и небольшой популяции паракумариловых спиртов, называемых H-лигниновыми звеньями.

Содержание S-лигнина различается в различных вторичных тканях растений. В основном он содержится в ксиларных сосудах и волокнах, а также в межфасцикулярных волокнах, где он обеспечивает структурную поддержку.

Чтобы определить наличие S-лигнина, возьмите залитые агарозой двудольные срезы стебля в пробирке. Обработайте срезы стебля последовательно раствором для окрашивания марганцовкой, затем разведенной соляной кислотой, и, наконец, гидроксидом аммония – слабым основанием.

Во время этого лечения фрагмент S-лигнина, присутствующий в клеточной стенке, претерпевает ряд изменений, чтобы в конечном итоге образовать продукт, который выглядит красным.

Интенсивность красной окраски ниже в ксилемных клетках из-за присутствия меньшего количества S-лигнина по сравнению с межфасцикулярными волокнами, которые кажутся более глубокими красными. Перенесите срезы на предметное стекло и визуализируйте их под световым микроскопом.

Изменение интенсивности красного цвета помогает понять относительное соотношение S-лигнина в одревесневших тканях растений.

Для окрашивания Мауле перенесите срезы стебля в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 1 миллилитр 0,5% раствора марганцовки в пробирку, содержащую срезы. Пипеткой аккуратно распыляйте 0,5% раствор марганцовки вверх и вниз, желательно, не нарушая срезы.

После 2-минутной инкубации и повторного пипетирования дайте микроцентрифужной пробирке постоять, пока все секции не сядут. С помощью пипетки объемом 1 миллилитр наберите 700 микролитров 0,5% раствора марганцовки. Добавьте 700 микролитров дистиллированной воды, чтобы смыть марганцовку. Повторите три-четыре раза или пока водный раствор не станет прозрачным.

Сбросив воду, быстро добавьте 1 миллилитр 3% соляной кислоты до тех пор, пока из секций не выйдет темно-коричневый цвет. Это может произойти в течение 3–5 минут или может потребоваться два мытья по 5 минут каждое. Измельчите пипеткой весь 3% раствор соляной кислоты и немедленно добавьте 1 миллилитр концентрированного раствора гидроксида аммония перед съемкой при ярком освещении.