Очистка белков на основе аниообменной хроматографии: метод разделения для выделения представляющего интерес белка из диализованного бактериального лизата на основе чистого заряда

Для анионообменной хроматографии отделения интересующего белка от лизата диализованного бактериального белка добавляют связывающий буфер для снижения вязкости лизата и предотвращения его засорения хроматографической колонки.

Хелатирующие агенты в буфере связывают двухвалентные катионы, подавляя активность протеазы и предотвращая деградацию белка. Кроме того, буфер с pH выше изоэлектрической точки белка-мишени, pI, pI, при котором белок не имеет суммарного заряда, заставляет избыток отрицательно заряженных гидроксильных ионов нейтрализовать положительно заряженные аминные группы белка, делая поверхность белка отрицательно заряженной.

Соберите колонку анионообменной хроматографии, содержащую сшитую неподвижную фазу на основе агарозы с положительно заряженными четвертичными аминными группами. Добавьте связующий буфер, чтобы подготовить колонку к максимальному взаимодействию белка во время загрузки образца. Загрузите разведенный бактериальный лизат.

Отрицательно заряженные белки-мишени более прочно связываются с положительно заряженными группами в колонке, чем менее отрицательно заряженные белки.

Запустите связывающий буфер, чтобы удалить несвязанные положительно заряженные белки из колонки. Пропустите элюирующий буфер через колонку, постепенно увеличивая концентрацию соли. При низких концентрациях солей отрицательные ионы конкурируют со слабо связанными белками за связывание с колонкой, вызывая их вымывание.

Впоследствии буфер с высокой концентрацией соли вытесняет плотно связанные белки, представляющие интерес, с более длительным временем удержания, элюируя целевые белки. Собранные целевые белки могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Запустите FPLC с общего обслуживания. Подсоедините колонные буферы AIEX-A и AIEX-B к буферным клапанам, а колонну, содержащую анионовую смолу, к колонным портам FPLC. Соответствующим образом отрегулируйте общие хроматографические параметры.

Запустите программу AIEX в программном обеспечении FPLC и выберите объем уравновешивания для буфера A. Впоследствии загрузите образец в колонку, и элюируйте белки с линейным градиентом от 0% до 100% буфера с высоким содержанием солей. Соберите 2-миллилитровые фракции во время элюирования.

Проанализируйте элюированные фракции после завершения прогона.