Катионообменная хроматография: метод выделения целевого рекомбинантного белка из лизата клеток насекомых на основе чистого поверхностного заряда

0 просмотров3:33 мин • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Катионообменная хроматография способствует отделению белков от смесей на основе их чистого поверхностного заряда.

Для выделения белка преобразователя сигнала-мишени из лизата белка клетки насекомого получают диализированный лизат белка-мишени, содержащий другие загрязняющие белки. Добавьте хлорид натрия в буфер для снижения вязкости лизата и улучшения растворимости белка, что помогает предотвратить засорение хроматографической колонки во время работы.

Кроме того, буферный pH ниже изоэлектрической точки белка-мишени, pI, при которой белок имеет нулевой суммарный заряд, способствует связыванию избыточных ионов водорода с отрицательными карбоксилатными группами, делая целевой белок положительно заряженным.

Соберите хроматографическую колонку, содержащую сшитые агарозные шарики, соединенные с отрицательно заряженными группами. Добавьте связывающий буфер для уравновешивания колонки и максимизации взаимодействия колонки с белком. Загрузите разведенный лизат на уравновешенную колонку.

Более положительно заряженные белки-мишени взаимодействуют и прочно связываются с отрицательно заряженными группами колонки, чем менее положительно заряженные загрязняющие белки.

Промойте колонку с буфером, чтобы удалить несвязанные отрицательно заряженные загрязняющие белки. Впоследствии пропускают элюирующий буфер, при этом постепенно увеличивая его ионную силу.

При низкой ионной силе существует минимальная конкуренция между положительными ионами и белками за отрицательные группы в колонке, элюирующие слабосвязанные, менее положительно заряженные загрязняющие белки. Однако, по мере увеличения ионной силы, ионы соли конкурируют с плотно связанными белками-преобразователями сигнала-мишени и уменьшают взаимодействие между белками и колонкой, элюируя их в виде очищенной фракции.

Приготовьте 20-миллилитровую катионообменную колонку, промыв ее тремя объемами колонки буфера G, затем тремя объемами колонки буфера F. Затем разбавьте 20 миллилитров диализованного образца до конечной концентрации хлорида натрия 100 миллимоляров, добавив 20 миллилитров буфера Е, и нанесите образец на обменную колонку.

Крайне важно разбавлять небольшое количество пробы, а не все сразу, а разведенные образцы следует наносить на колонку сразу после разведения, чтобы ограничить осаждение белка.

Продолжайте нагружать колонку свежеразведенным образцом по мере того, как предыдущее разведение приближается к концу загрузки. Затем промойте колонку до базовой абсорбции 280 с помощью буфера F, для которого обычно требуется три объема колонки.

Вымывайте белок из колонки с 400-миллилитровым градиентом от буфера F до 65% буфера G, собирая элюат в 6-миллилитровые фракции. После того, как градиент будет завершен, продолжайте промывку колонки для дополнительных 1,5 объемов колонки с содержанием 65% буфера G.

07:50

Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза

Похожие видео

0 Просмотры

10:41

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Похожие видео

0 Просмотры

10:14

Хроматографическая дактилоскопия путем сопоставления шаблонов для данных, собранных с помощью комплексной двумерной газовой хроматографии

Похожие видео

0 Просмотры

10:21

Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков

Похожие видео

0 Просмотры

03:28

Селективная очистка бактериального белка методом отрицательной ионообменной хроматографии

Похожие видео

0 Просмотры

02:54

Метод аффинитной хроматографии для очистки рекомбинантного бактериального белка

Похожие видео

0 Просмотры

02:59

Очистка белков на основе аниообменной хроматографии: метод разделения для выделения представляющего интерес белка из диализованного бактериального лизата на основе чистого заряда

Похожие видео

0 Просмотры

03:54

Очистка белков на основе аффинной хроматографии никеля: метод очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином, от лизата бактериальных клеток

Похожие видео

0 Просмотры

10:37

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Похожие видео

0 Просмотры

07:07

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 1 августа 2026