Разделение бактериальных внеклеточных везикул на основе эксклюзионной хроматографии: метод выделения гетерогенной популяции грамнегативных бактериальных наружных мембранных везикул в зависимости от их размера

При подходящих условиях культивирования грамотрицательные бактерии выделяют несущие груз внешние мембранные везикулы, или OMV, в надосадочную жидкость. Эти везикулы представляют собой неоднородные, маленькие, сферические структуры, которые опосредуют клеточную коммуникацию.

Чтобы фракционировать субпопуляции OMV разного размера, возьмите пустую колонку для эксклюзионной хроматографии с соответствующим фильтром в ее основании для поддержки матрицы.

Наполните колонку гелевой фильтрующей матрицей, состоящей из химически инертных сферических шариков с определенным размером пор, обеспечивая оптимальный размер для исключения попадания OMV большого размера. Уравновесьте колонну с помощью соответствующего буфера, чтобы предотвратить высыхание шариков для оптимальной очистки.

Загрузите надосадочную жидкость бактериальной культуры, содержащую субпопуляции OMV, белковых агрегатов и нуклеиновых кислот разного размера, в верхнюю часть колонки. Позвольте образцам работать под действием силы тяжести.

По мере того, как образцы проходят через колонку, более крупные OMV, которые не могут проникнуть в поры, перемещаются через межчастичные пространства между гелевыми шариками, чтобы сначала получить элюирование. Между тем, меньшие OMV проникают в поры матрицы, проходят более длинный путь и позже элюируются.

Из-за своего меньшего размера белки агрегируют и нуклеиновые кислоты проникают в различные поры матрицы, в результате чего они имеют самое длительное время удержания в колонке и элюируются как последние фракции. Соберите отдельные элюаторы OMV и сохраните их для дальнейшего анализа.

Для начала с помощью стеклянного стержня смешайте бутылочку с гелевым фильтрующим материалом и налейте объем, необходимый для заполнения колонки плюс примерно 50% избытка, в стеклянную бутылку. Дайте шарикам отстояться, и сцедите лишнюю жидкость. Суспендируйте шарики в элюирующем буфере до конечного раствора, содержащего примерно 70% геля и 30% буфера, и дегазируйте раствор под вакуумом.

Установите колонну на кольцевую подставку в вертикальном положении и заполните колонну элюирующим буфером, чтобы смочить стены, перед тем как слить буфер до тех пор, пока не останется всего около 1 сантиметра. Затем осторожно впихивайте гелевые шарики в колонку, одновременно сливая лишний буфер, чтобы предотвратить оседание гранул, до тех пор, пока колонка не уложится на высоту примерно на 2 сантиметра ниже дна резервуара колонки.

Перед загрузкой образца дегазируйте элюирующий буфер под вакуумом. Промойте колонку примерно в два раза больше объема буфера для элюирования. Как только буфер достигнет верхнего слоя геля, осторожно добавьте 2 миллилитра из 100-200 наномолей на литр образца везикулы внешней мембраны поверх слоя геля, не нарушая поверхность, и дайте образцу войти в гель.

Медленно добавьте буфер для элюирования в колонку, не нарушая слой геля, и подложите под колонку 50-миллилитровую трубку. Чтобы предотвратить высыхание колонны, одновременно добавьте буфер элюирования в верхнюю часть колонки.

Набрав 20 миллилитров элюата, поставьте под колонну стеллаж с 1,5-миллилитровыми пробирками. Соберите в общей сложности 96 1-миллилитровых фракций в каждой пробирке. Во время сбора образцов непрерывно добавляйте буфер элюирования в колонку. Чтобы очистить колонку, пропустите через колонку 1 объем 0,1 молярного гидроксида натрия, а затем 2 объема буфера для элюирования.