JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:46 мин • July 8th, 2025
Конъюгаты антитело-лекарство - АЦП - образуются путем присоединения моноклонального антитела-мишени к цитотоксическим препаратам с помощью подходящих линкеров. В процессе стохастической конъюгации создаются АЦП с разным числом лекарственных частей.
Виды ADC характеризуются соотношением лекарственного препарата к антителам или DAR, что определяет их терапевтическую эффективность. Гидрофобность АЦП делает их подходящими кандидатами для гидрофобной взаимодействия, жидкостной хроматографии или характеризации на основе HIC.
Для начала соберем хроматографическую колонку, содержащую стационарную фазу на основе агарозной матрицы. Матрица сшита с бутиловыми фрагментами - гидрофобными алкильными функциональными группами. Уравновесьте колонку с помощью буфера с высоким содержанием солей. После этого загрузите решение АЦП в колонку.
Ионы соли в буфере вытесняют молекулы воды вокруг АЦП, обнажая их гидрофобные области. Это позволяет АЦП связываться с бутиллигандами посредством гидрофобных взаимодействий. АЦП с большим числом связанных лекарственных фрагментов демонстрируют более сильное взаимодействие со колонкой.
Медленно замените буфер с высоким содержанием соли на буфер для элюирования с низкой концентрацией соли. Этот процесс постепенного снижения концентрации соли называется градиентным элюированием.
Уменьшение ионов соли позволяет молекулам воды окружать АЦП, нарушая их взаимодействие с лигандами. Первыми элюируются АЦП с наименьшим числом связанных лекарственных фрагментов, за которыми следуют виды с более высоким DAR.
Контролируйте элюирование для определения характеристик АЦП в соответствии с их DAR.
Для анализа сопряженного вещества уравновесьте колонку ВЭЖХ-HIC со 100% высокосолевым буфером в течение 5 минут. Затем смешайте 15 микролитров раствора трастузумаба 1 мг/мл, связанного с MMAE, с 15 микролитрами 2X высокосолевого буфера во флаконе. Введите смесь в колонку ВЭЖХ. Разбавьте изократическим потоком 1 мл/мин со 100% буфером с высоким содержанием соли в течение одной минуты.
Затем следует 15-минутный градиент от 100% до 0% от буфера с высоким содержанием соли в буфере с низким содержанием соли. Контролируйте элюирование на 280 нанометрах. Интегрируйте пики на хроматограмме со временем удержания 7,5, 9,2 и 11,5 минут, что соответствует трастузумабу с нулевым, одним и двумя конъюгированными токсинами соответственно.
Теперь рассчитайте DAR, сложив площади вершин в 9,2 минуты, которая имеет вес 1, и 10,5 минуты, которая имеет вес 2, и разделите на общую площадь трех вершин.