Обратимая фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография: надежный метод количественного определения флуоресцентно меченных и дериватизированных сиаловых кислот, выделенных из печени мышей

Сиаловые кислоты, такие как N-ацетилнейраминовая кислота и N-гликолилнейраминовая кислота, представляют собой отрицательно заряженные углеводные фрагменты, обнаруженные на дистальных концах олигосахаридных цепей на поверхности клеток млекопитающих.

Чтобы количественно определить относительные количества этих сиаловых кислот в ткани печени мышей с помощью обратившейся высокоэффективной жидкостной хроматографии или RP-ВЭЖХ, сначала обрабатывают выделенную смесь сиаловых кислот дериватизационным агентом. Дериватизационный агент взаимодействует с функциональными группами сиаловых кислот, образуя стабильные флуоресцентные производные сиаловой кислоты.

Соберите колонку RP-HPLC, подключенную к флуоресцентному детектору. Колонка содержит пористую неподвижную фазу на основе диоксида кремния, связанную с неполярными, гидрофобными, алкильными лигандами цепи для облегчения селективного взаимодействия с производными сиаловой кислоты во время хроматографического прогона.

Уравновесьте колонку с помощью водной полярной подвижной фазы, содержащей низкие концентрации ацетонитрила, менее полярного органического растворителя, для оптимального кондиционирования колонки.

Загрузите в колонну дериватизированную смесь сиаловой кислоты.

N-ацетилнейраминовая кислота, содержащая гидрофобную N-ацетильную группу, сильнее адсорбируется к гидрофобным лигандам стационарной фазы, чем N-гликолилнейраминовая кислота с гидрофильной N-гликолильной группой.

Анализируйте образцы с помощью стандартной системы ВЭЖХ, подключенной к онлайн-детектору флуоресценции. Для анализа используйте колонну C-18 с обратной фазой длиной 250 мм и диаметром 4,6 мм.

После подготовки растворителя А и растворителя В и настройки прогона ВЭЖХ, как описано в текстовом протоколе, введите 50 микролитров образца в систему ВЭЖХ.

Мониторинг элюентов с помощью флуоресцентного детектора с длиной волны возбуждения 373 нм и длиной волны излучения 448 нм.

Наконец, рассчитайте относительное количество Neu5Gc, как описано в текстовом протоколе.