Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:05 мин. • July 8th, 2025
Бактериальные интегральные мембранные белки, закрепленные на липидных бислойных мембранах, облегчают транспортировку молекул через мембраны и передачу сигналов. Для структурных исследований специфические интегральные мембранные рекомбинантные белки сверхэкспрессируются с помощью слитого зеленого флуоресцентного белка GFP.
Для оценки стабильности рекомбинантных мембранных белков после детергентной солюбилизации получают бактериальную мембранную фракцию, содержащую GFP-меченые интегральные мембранные белки. Добавьте неионогенное моющее средство. За пределами критической концентрации моющее средство образует мицеллы.
Мицеллы взаимодействуют с липидными мембранами и мембранными белками, солюбилизируя мембраны и образуя белково-детергентные комплексы. Кроме того, гидрофобные трансмембранные области мембранных белков могут оставаться незамаскированными, вызывая агрегацию белков. Кроме того, свободные GFP могут возникать из-за деградации мембранных белков.
Центрифугируйте смесь. Соберите моюще-растворимую фракцию, содержащую надосадочную жидкость.
Соберите колонку для эксклюзионной хроматографии, подключенную к флуоресцентному детектору. Матрица колонки состоит из шариков агарозы с размерами пор, определяющими широкий диапазон фракционирования.
Уравновесьте колонку с буфером, содержащим детергент, чтобы свести к минимуму неспецифические взаимодействия и поддерживать солюбилизацию белка.
Загрузите в колонку растворимую мембранную фракцию. Белковые агрегаты обходят самые большие поры и перемещаются через межчастичные пространства между бусинами, сначала нанося покрытие. Более мелкие белково-моющие комплексы проникают в несколько пор в гранулах, проходя более длинный путь, и позже элюируются. Свободные GFP проникают во все поры бусин и вымываются в последнюю очередь. Флуоресцентный детектор анализирует элюированные фракции, детектируя излучаемую GFP флуоресценцию.
Симметричные пики флуоресценции белково-детергентных комплексов с минимальными агрегатами и свободным GFP указывают на пригодность детергента для солюбилизации мембранных белков.
Для флуоресцентно-эксклюзионной хроматографии или анализа FSEC затем уравновесьте колонку исключения размера с широким диапазоном фракционирования с проточным буфером со скоростью 0,3 миллилитра в минуту. Затем введите 100 микролитров солюбилизированного образца мембраны в колонку с той же скоростью потока и контролируйте профиль иллюзии с помощью флуоресцентной оптики.