Анализ активности ферментов на основе тонкослойной хроматографии: метод определения активности пирофосфокиназы in vitro с помощью тонкослойной хроматографии

Пирофосфокиназа катализирует перенос дифосфата или пирофосфата от предшественника нуклеотидов, таких как аденозинтрифосфат, АТФ, к субстрату, такому как гуанозиндифосфат, ГДФ. При этом образуется гуанозинтетрафосфат – важная сигнальная молекула.

Чтобы определить активность пирофосфокиназы, приготовьте реакционную смесь, содержащую ГДФ и меченые радиоактивными метками АТФ в подходящем буфере с добавлением хлорида магния. Добавьте в реакционную смесь нужное количество пирофосфокиназы и инкубируйте.

Со временем, в присутствии ионов магния, пирофосфокиназа начинает переносить меченую пирофосфатную часть из АТФ в ВВП, производя радиоактивный гуанозинтетрафосфат.

Теперь возьмем тонкослойную хроматографию или ТСХ, пластину, покрытую полиэтиленимин-целлюлозой - неподвижной фазой на основе катионного полимера. Определите аликвоты аналитов реакционной смеси рядом с основанием пластины TLC в разные моменты времени, чтобы остановить реакцию и оценить ход ее протекания.

Погрузите пластину в стеклянную камеру, содержащую одноосновной фосфат калия - растворитель подвижной фазы. По мере того, как фронт растворителя движется вверх, отрицательно заряженные аналиты начинают мигрировать в зависимости от их сродства с положительно заряженной стационарной фазой.

Различия в отрицательных зарядах и весе по-разному фосфорилированных аналитов определяют их относительную миграцию на пластине TLC, позволяя им иммобилизоваться в виде отдельных полос.

Когда фронт растворителя достигнет желаемого расстояния, снимите пластину и высушите на воздухе. Измерьте интенсивность радиоактивного сигнала, соответствующую истощению радиоактивно меченого АТФ и накоплению гуанозинтетрафосфата для анализа активности пирофосфокиназы.

Перед проведением реакции подготовьте пластины для тонкослойной хроматографии из полиэтиленовой целлюлозы, промыв их в деионизированной воде. Поместите тарелки в стеклянную камеру с двойной дистиллированной водой, на глубину примерно 0,5 сантиметра. Дав воде мигрировать к верхней части тарелки, выньте тарелки из стеклянной камеры и оставьте на настольной решетке сушиться на ночь.

Отметьте сухие пластины в 2 сантиметрах от одного края мягким карандашом, чтобы указать, где будут наноситься образцы для TLC. Для образцов объемом 2 микролитра наносите образцы на расстоянии не менее 1 сантиметра друг от друга. Планируя эксперименты, всегда оставляйте одно место на каждой пластине неиспользованным, чтобы оно служило пустой полосой для количественного определения образца.

Для проведения анализа активности фермента необходимо подготовить индивидуальные реакции с использованием ^γ-32P-АТФ, как описано в текстовом протоколе. Добавьте RSH после смешивания других компонентов, так как добавление RSH к нуклеотидсодержащей смеси инициирует анализ ферментативной активности.

Чтобы контролировать гидролиз АТФ от загрязняющей нуклеазной активности, соберите 10-микролитровую реакцию, не содержащую белка, и инкубируйте ее параллельно. Выявить 2 микролитровые образцы при t = 0, а в конце эксперимента убедиться, что АТФ не гидролизуется в отсутствие белка.

Сразу после добавления РСГ удалите 2 микролитра и нанесите его на маркированную пластину PEI-целлюлозы как образец t = 0 минут.

Инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия, удаляя 2 микролитра аликвот в желаемые моменты времени. После того, как все аликвоты были собраны, проводят тонкослойную хроматографию, заполняя хроматографическую камеру 1,5 молярным моноосновным фосфатом калия на глубину до 0,5 сантиметра. Погрузите нижний край пластины в растворитель и дайте растворителю мигрировать к верхней части пластины в течение примерно 90 минут.

Извлеките пластину из резервуара для хроматографии и поместите ее на настольную сушилку для сушки на воздухе в течение ночи. После того, как пластина высохнет, оберните ее полиэтиленовой пленкой, чтобы избежать попадания радиоактивного материала на кассету для визуализации, и проанализируйте с помощью авторадиографии.

Подвергнуть воздействию полиэтиленово-целлюлозной пластины, содержащей разделенные реакции, на кассету с фосфоримиджером на четыре часа при комнатной температуре. После экспонирования визуализируйте кассету на люминоимидж-сканере.

Используя программное обеспечение для обработки изображений с графическим пользовательским интерфейсом, нарисуйте области интереса или ROI, сначала выбрав «Нарисовать прямоугольник». Затем с помощью мыши нарисуйте прямоугольные ROI вокруг одной целой полосы и пятен АТФ и тетрафосфата гуанозин, содержащихся в этой полосе.

Используйте команды «Выбрать, Копировать и Вставить», чтобы нарисовать идентичные ROI на других полосах, чтобы гарантировать, что ROI измеряют сигналы в идентичных областях на каждой полосе. Включите ROI с неиспользуемой полосы, которые будут использоваться в качестве пустых вариантов.

С помощью функции "Analyze | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций | Добавить» программного обеспечения для обработки изображений, выберите все показатели рентабельности инвестиций, нарисованные на пластине PEI-целлюлозы. Теперь воспользуйтесь функцией "Анализ | Установить мерки | Измерить» для количественной оценки интенсивности сигнала в рамках каждого ROI и экспорта измерений в виде электронной таблицы. В таблице вычтите пустые значения ROI из экспериментальных сигналов.