Анализ активности ферментов на основе тонкослойной хроматографии: метод определения активности пирофосфокиназы in vitro с помощью тонкослойной хроматографии

Пирофосфокиназа катализирует перенос дифосфата или пирофосфата от предшественника нуклеотидов, таких как аденозинтрифосфат, АТФ, к субстрату, такому как гуанозиндифосфат, ГДФ. При этом образуется гуанозинтетрафосфат – важная сигнальная молекула.

Чтобы определить активность пирофосфокиназы, приготовьте реакционную смесь, содержащую ГДФ и меченые радиоактивными метками АТФ в подходящем буфере с добавлением хлорида магния. Добавьте в реакционную смесь нужное количество пирофосфокиназы и инкубируйте.

Со временем, в присутствии ионов магния, пирофосфокиназа начинает переносить меченую пирофосфатную часть из АТФ в ВВП, производя радиоактивный гуанозинтетрафосфат.

Теперь возьмем тонкослойную хроматографию или ТСХ, пластину, покрытую полиэтиленимин-целлюлозой - неподвижной фазой на основе катионного полимера. Определите аликвоты аналитов реакционной смеси рядом с основанием пластины TLC в разные моменты времени, чтобы остановить реакцию и оценить ход ее протекания.

Погрузите пластину в стеклянную камеру, содержащую одноосновной фосфат калия - растворитель подвижной фазы. По мере того, как фронт растворителя движется вверх, отрицательно заряженные аналиты начинают мигрировать в зависимости