Газовая хроматография в свободном пространстве: метод оценки концентрации этанола в эмбрионах рыбок данио-рерио

Чтобы проанализировать концентрацию этанола - летучего органического соединения, начните со взятия гомогенизированного обработанного этанолом супернатанта культуры эмбрионов данио-рерио в хроматографическую пробирку. Надосадочная жидкость содержит помимо этанола и другие нелетучие органические соединения. Поместите запечатанный флакон в пробоотборник хроматографической сборки и нагрейте его до соответствующей температуры.

Во время нагревания этанол испаряется и мигрирует в газовую фазу или свободное пространство, оставляя после себя нелетучие остатки. Это позволяет пробоотборнику вводить газообразный этанол в непрерывный поток газа-носителя. Это действует как подвижная фаза.

Этанол проходит через предварительно нагретую спиральную хроматографическую колонку, которая содержит насадочный слой жидкой неподвижной фазы. Благодаря своей летучести и полярности движущиеся молекулы этанола начинают адсорбироваться на частицах неподвижной фазы, разделяясь на неподвижную фазу.

Из-за высокой температуры столба адсорбция молекул этанола является нестабильной и временной, что позволяет этим молекулам постепенно десорбироваться и мигрировать по потоку газа-носителя. Эти молекулы этанола претерпевают ряд событий адсорбции-десорбции по всей длине колонны.

Впоследствии этанол поступает в камеру детектирования, которая помогает определить его концентрацию в образце, соответствующую площади под кривой на полученной хроматограмме.

Используйте две микропипетки p200, установленные на 50 микролитров, и отсадите раствор коктейля протеазы в одну, а воду во вторую. Затем быстро поместите 10 эмбрионов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра с помощью стеклянной пипетки и закройте крышку. Повторите этот процесс для всех образцов, подлежащих тестированию, контрольных образцов и эмбрионов, обработанных этанолом.

Работая с одним образцом за раз, быстро откройте колпачок и аспирируйте всю остаточную среду эмбриона с помощью микропипетки p200, установленной до 200 микролитров. Быстро, но осторожно добавьте и удалите 50 микролитров воды, затем добавьте 50 микролитров коктейля из протеазы и закройте крышку тюбика.

Дайте образцу постоять 10 минут при комнатной температуре, затем быстро добавьте 450 микролитров 5 моляров хлорида натрия и закройте крышку пробирки. Гомогенизируйте образец путем вортексирования в течение 10 минут и перенесите 2 микролитра надосадочной жидкости в флакон для газовой хроматографии. Закупорьте флакон крышкой из политетрафторэтилена.

После завершения метода запуска, загрузите 436 Current spme ethanol 2013 3-минутное поглощение 2_5min rg run. METH из меню «Методы» в программном обеспечении для анализа для каждого образца в списке образцов. Заполните список образцов, начиная с воздуха, воды и 5 заготовок коктейля из протеазы молярного хлорида натрия. Затем введите в нормы этанол в порядке от 0,3125 до 40 миллимоляров.

Следуйте стандартам со вторым раундом заготовок. Введите все образцы надосадочной жидкости гомогенизированных эмбрионов, подлежащие тестированию, от самой низкой до самой высокой прогнозируемой концентрации этанола, и завершите вводом третьего раунда пустых концентраций.

Добавьте флаконы с газовой хроматографией в автоподатчик в том порядке, в котором образцы были введены, и дайте им нагреться в течение 10–15 минут. Затем запустите выборку прогонов с помощью программного обеспечения. После завершения всех прогонов активируйте метод завершения работы, добавив окончательный образец в список образцов и запустив режим ожидания. МЕТ. Создайте резервную копию всех данных, полученных во время выполнения выборки.

Как только метод выключения будет завершен, нажмите «Открыть хроматограмму» и откройте папку с результатами. Образцы автоматически интегрируются в эту программу. В результатах убедитесь, что интегрированы правильные пики. После того, как все образцы будут подтверждены, распечатайте или экспортируйте результаты.

Нанесите на график пиковую высоту стандартов этанола. Затем рассчитайте значения наклона, Y-образного пересечения и R-квадрата. Получите значение этанола для каждой пробы, вычитая пиковую высоту образца из Y-точки пересечения стандартов и деля это значение на наклон стандартов.

Чтобы рассчитать концентрацию этанола в эмбрионах, рассчитайте коэффициент разбавления для каждого образца и умножьте значение этанола образца на этот коэффициент разбавления. Наконец, рассчитайте эталонные образцы среды, умножив значение этанола в среде на коэффициент разбавления, равный 10.