Применение постоянных средней мозговой артерии Лигирование в мышь
25 июля 2011 г.
Средней мозговой артерии (СМА) лигирование является методика исследования координационного ишемии мозга на животных моделях. В этом методе, средней мозговой артерии, предоставляемые трепанации черепа и лигируют путем прижигания. Этот метод дает очень воспроизводимые инфаркта объемов и увеличение послеоперационной выживаемости по сравнению с другими методами.
Общая цель данной процедуры — изучение очаговой ишемии головного мозга на моделях животных. Для этого сначала делают небольшой разрез кожи между левым глазом и основанием ушной раковины. Затем в месте соединения скуловой дуги и чешуйчатой кости проводят краниотомию для обнажения средней мозговой артерии, после чего среднюю мозговую артерию перевязывают с помощью коагулятора для мелких сосудов.
В завершение кожу зашивают для закрытия раны. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие инфаркт, локализованный в левом полушарии мозга мыши. Для визуализации инсульта мозг можно окрасить TTC или просканировать с помощью МРТ.
Мозг после инсульта также может быть использован для определения экспрессии белков или мРНК. Здравствуйте, я Гарза Чола, аспирант лаборатории Гейл Джонсон в Университете Рочестера.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения инсульта, например, проиллюстрировать механизмы, приводящие к гибели клеток в ишемизированном мозге. Для подготовки к операции стерилизуйте все хирургические инструменты, марлевые салфетки и когнитивные аппликаторы в автоклаве. В ходе операции держите хирургические инструменты в 70% ethanol, а непосредственно перед использованием просушивайте их на стерильной марле на воздухе.
За два часа до операции обработайте рабочую зону распылением 70% ethanol. Введите мыши бупренорфин в дозе 0.05 milligrams per kilogram. Препарат вводится повторно сразу после операции, а затем каждые три-пять часов в течение первых 24 hour послеоперационного периода.
Используйте испаритель анестетика, чтобы наркотизировать мышь смесью 3% изофлурана и 20% кислорода. Регулируйте подачу кислорода с помощью расходомера. Проверяйте глубину анестезии путем зажима пальца на лапе или хвоста.
Поддерживайте уровень анестезии с помощью 2% изофлурана. Закапайте в глаза мыши искусственные слезы, соблюдая осторожность, чтобы не повредить глаз в ходе хирургической процедуры.
Поместите мышь на правый бок в латеральное положение, используя фиксатор для животных. Выбрейте шерсть на левой стороне в области между левым глазом и основанием левого уха. Очистите эту область, поочередно используя раствор бетадина и 70% этиловый спирт; наносите средства с помощью ватных палочек, слегка протирая кожу.
Необходимо повторить процедуру. Поместите мышь на греющую подушку, подключенную к ректальному датчику. Для поддержания температуры тела на уровне 37 °C введите ректальный датчик, используя минеральное масло. Положите мышь на правый бок под микроскопом и зафиксируйте ее лентой.
Прорежьте отверстие в марлевой салфетке и прикройте операционное поле, используя тонкие прямые ножницы. Сделайте вертикальный разрез между левым глазом и основанием левого уха. Если в ходе операции наблюдается чрезмерное высыхание тканей, используйте изогнутые гемостаты для обеспечения доступа к операционному полю.
С помощью ватных тампонов нанесите стерильный PBS. Используя пружинные ножницы, сделайте горизонтальный разрез височной мышцы и медленно раздвиньте ткани пинцетом, чтобы слегка отделить височную мышцу от черепа. Зафиксируйте челюстную кость изогнутым пинцетом и с помощью иглы 18-го калибра выполните небольшую субтемпоральную краниотомию в месте соединения скуловой дуги и чешуйчатой части височной кости.
С помощью костных кусачек удаляют небольшие фрагменты черепа, чтобы обнажить MCA. В ходе этого процесса следует избегать повреждения скуловой дуги и содержимого глазницы. С помощью коагулятора для мелких сосудов лигируют дистальный отдел MCA, возвращают височную мышцу в исходное положение и накладывают швы нейлоновой нитью 5-0.
Чтобы закрыть место разреза, прекратите подачу анестезии и извлеките ректальный датчик. Введите мыши вторую дозу бупренорфина подкожно. Поместите мышь обратно в клетку, которая поддерживалась при температуре 37 °C.
С использованием нагревательной панели. В течение следующих 24 часов внимательно наблюдайте за мышью на предмет любого дискомфорта, включая снижение аппетита или потребления воды, сгорбленную осанку, учащенное дыхание или пилоэрекцию шерсти. Сразу после операции обеспечьте мыши доступ к восстанавливающему гелю.
Подождите два-три часа после операции. Затем вводите мыши бупренорфин подкожно каждые три-пять часов в течение 24 часов. Через 24 часа после операции глубоко анестезируйте мышь и проведите перфузию 4% TTC.
Извлеките мозг и поместите его в 4% раствор параформальдегида на ночь. На следующий день зафиксируйте мозг в блоке для секционирования. С помощью лезвий бритвы нарежьте мозг на срезы толщиной один миллиметр.
Поместите срезы рядом с миллиметровой шкалой. С помощью цифровой камеры, подключенной к диссекционному микроскопу, сфотографируйте срезы в программном обеспечении ImageJ.
Нажмите на меню «Файл» и откройте нужное изображение. Перейдите на вкладку «Прямая линия» в программе. Проведите прямую линию между двумя метками на линейке.
Нажмите на меню Analyze (Анализ) и выберите Set Scale (Установить масштаб). Установите известное расстояние, равное one, и единицу длины — millimeter. Перейдите на вкладку Freehand Circle (Окружность на свободном ходу).
Обведите контур контралатерального полушария кругом. Откройте меню анализа (analyze) и выберите пункт «измерить» (measure). Появится окно расчета, в котором будет указана площадь нарисованного круга.
Обведите еще одним кругом ипсилатеральное полушарие, исключая область белого штриха. Измерьте площадь, как было показано ранее. Новое значение будет добавлено в окно расчетов.
Разница между первым и вторым значениями представляет собой площадь инфаркта. Рассчитайте площадь инсульта в каждом срезе, повторив вышеописанные шаги для толщины среза в один миллиметр. Рассчитайте объем инсульта, суммируя площадь инсульта, вычисленную для каждого среза.
На данном рисунке показано окрашивание мозга TTC через 24 часа после постоянного лигирования средней мозговой артерии (MCA) у мыши линии C 57 BL six дикого типа. Очаг инсульта выглядит белым и представлен при различном увеличении и с разных ракурсов. Здесь показаны срезы окрашенного TTC мозга с инсультом толщиной 1 мм, расположенные от переднего к заднему краю инфаркта.
Объем был рассчитан через 24 часа после операции. Объем инфаркта составляет приблизительно 23 кубических миллиметра. При правильном выполнении эта методика занимает 30 минут.
Спасибо за просмотр.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод лигирования средней мозговой артерии (СМА) используется для изучения очаговой ишемии головного мозга на моделях животных. Данный метод предполагает обнажение и перевязку средней мозговой артерии, что позволяет добиться воспроизводимого объема инфаркта и повысить показатели послеоперационной выживаемости.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования инсульта
- Модели на животных
Теоретическая часть
- Очаговая ишемия головного мозга является критически важной областью исследований для понимания механизмов инсульта.
- Метод перевязки средней мозговой артерии (СМА) позволяет проводить контролируемые эксперименты.
- Модели на животных дают представление о механизмах инсульта у людей.
- Повышение показателей выживаемости увеличивает достоверность результатов.
Цель исследования
- Исследование эффектов фокальной ишемии головного мозга.
- Оценка объемов инфаркта в контролируемых условиях.
- Углубление понимания патологии инсульта.
Используемые методы
- Разрез выполняется между левым глазом и основанием ушной раковины.
- Трепанация черепа проводится на уровне скуловой дуги и чешуйчатой части височной кости.
- Средняя мозговая артерия перевязывается с помощью коагулятора для малых сосудов.
- После завершения процедуры кожа зашивается для закрытия раны.
Основные результаты
- Инфаркт расположен в левом полушарии мозга мыши.
- Визуализация инсульта была осуществлена с помощью окрашивания TTC или МРТ.
- Результаты демонстрируют эффективность метода лигирования СМА.
- Отмечена высокая воспроизводимость объемов инфаркта.
Выводы
- Лигирование средней мозговой артерии (СМА) является надежным методом изучения очаговой ишемии головного мозга.
- Повышение показателей выживаемости способствует достоверности полученных результатов.
- Данный метод может быть использован для дальнейшего исследования способов терапии инсульта.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной индустрии
Модель перманентного лигирования средней мозговой артерии представляет собой воспроизводимую систему для изучения фокальной ишемии головного мозга, позволяющую проводить механистическую проверку безопасности нейропротекторных соединений в доклинических исследованиях инсульта. Создавая стабильные объемы инфаркта у мышей, данный метод способствует валидации мишеней и разработке анализов для терапевтических кандидатов, направленных на решение неудовлетворенных медицинских потребностей при ишемическом инсульте. Ее релевантность патологии человека, при которой ~80% инсультов происходят в бассейне СМА, повышает трансляционную достоверность и эффективность сортировки портфеля препаратов на ранних этапах разработки.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы о путях развития ишемии посредством контролируемого индуцирования фокальной ишемии.
- Научная ценность: способствует биологическому снижению рисков путем уточнения роли мишени в формировании ядра инфаркта и пенумбры.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимую количественную оценку инфаркта с помощью окрашивания ТТХ, что облегчает последовательную оценку взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для скрининга соединений путем создания релевантной модели ишемии при данной патологии.
- Практическая ценность: Стандартизация измерения инфаркта с помощью волюметрии на основе TTC, что позволяет проводить количественный анализ зависимости «доза-эффект».
- Практическая ценность: Повышение воспроизводимости анализа при уровне выживаемости ~80%, что снижает вариативность фармакологических показателей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует патологию инсульта у человека с высокой анатомической и патофизиологической релевантностью по отношению к инфарктам в бассейне средней мозговой артерии (СМА).
- Научная ценность: Позволяет оценивать механизмы внутриклеточного ответа на гипоксию in vivo, что способствует поиску новых биомаркеров.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации благодаря стандартизированным протоколам хирургического вмешательства и окрашивания.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки — от валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, предоставляя платформу для снижения рисков за счет изучения механизмов действия терапевтических средств при инсульте.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез относительно нейропротекторных мишеней, обеспечивая контролируемое нанесение ишемического повреждения и количественную оценку инфаркта.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного окрашивания TTC, позволяя получать количественные данные об объеме инфаркта для оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет получать волюметрические измерения (например, инфаркт ~23 mm³ через 24h), что дает возможность сравнивать различные условия и определять величину эффекта.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническим этапом за счет локализации инфаркта, имитирующей паттерны инсульта у человека, что способствует продвижению исследований с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: Служит в качестве воспроизводимой платформы для оценки множества соединений в рамках различных проектов благодаря высокой повторяемости и стандартизированным конечным точкам.
Операционное и организационное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в ишемических путях.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным процедурам краниотомии, лигирования и окрашивания ТТЦ.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет предоставления надежных данных об инфаркте, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ по лечению инсульта.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов в нейропротекторы с учетом рисков на основе согласованных сигналов доклинической эффективности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии грызунов и нейроанатомической идентификации MCA.
- Зависит от наличия микрохирургического инструментария, включая коагуляторы сосудов, нагревательные маты и инструменты для прецизионного наложения швов.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов анестезии, анальгезии и послеоперационного мониторинга.
- Требуется адаптация методов при переходе от моделей крыс к моделям мышей, включая подбор размера шовного материала и точность окклюзии.
- Ограничено необходимостью терминальных точек для количественной оценки инфаркта с помощью окрашивания TTC или МРТ.
