Дифференциальное радиально-капиллярное действие лигандного анализа: высокопроизводительный метод идентификации бактериальных нуклеотидных вторичных мессенджер-связывающих внутриклеточных белков

Бактерии вырабатывают нуклеотидные вторые мессенджеры, NSM – внутриклеточные сигнальные молекулы – в ответ на соответствующие раздражители. Эти молекулы связываются с белками-мишенями и регулируют функции бактерий.

Для идентификации этих белков-мишеней с помощью дифференциального радиального капиллярного действия лигандного анализа берут многолуночный планшет с лизатом бактериальных клеток, содержащим растворимые белки. Эти белки получены из различных бактериальных клонов, экспрессирующих отдельные ORF - открытые рамки считывания - в геноме, гарантируя, что каждая лунка имеет отдельный белок.

Добавьте смесь тетра- и пентафосфатов гуанозина - НСМ, меченных радиоактивным фосфором. Эти молекулы связываются с белками-мишенями в лизате. С помощью булавочного инструмента соберите равное количество жидкости из каждой лунки. Поместите средство на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы жидкость отложилась в виде пятен.

Белки-мишени связываются с мембраной посредством нековалентных взаимодействий, предотвращая их диффузию. Это изолирует связанные радиоактивно меченые NSM в центральной точке нанесения. Свободные NSM радиально диффундируют с жидкой фазой за счет капиллярного действия.

Используйте люминофорную визуализацию для обнаружения радиоактивных сигналов и получения цифрового изображения пятен. Определите пятна с помощью двух кругов. На внешнем изображена периферия диффузных НСМ. Внутренний круг представляет собой изолированные NSM.

Рассчитайте фракцию связывания - интенсивность радиоактивности, обнаруженной из внутреннего круга, над общей радиоактивностью диффузионного пятна. Найдите пятна с высокой долей связывания, чтобы идентифицировать лунки с NSM-связанными белками-мишенями.

Для скрининга целевых белков методом DRaCALA добавьте 20 микролитров размороженных цельноклеточных лизатов в отдельные лунки 96-луночного микротитровального планшета с V-образным дном и добавьте в каждую лунку по 2,5 единицы эндонуклеазы Serratia marcescens. Через 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия поместите лизаты на лед на 20 минут.

Затем смешайте равные объемы фосфора 32-меченного пентафосфата гуанозина и тетрафосфата гуанозина и добавьте в смесь 1x буфер для лизиса #1 для получения четырех-наномолярного раствора пентафосфата гуанозина.

С помощью многоканальной пипетки и отфильтрованных наконечников пипетки смешайте 10 микролитров смеси гуанозина пентафосфата с клеточным лизатом для пятиминутной инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации трижды промойте штифтовый инструмент 96X в 0,01% растворе неионогенного моющего средства в течение 30 секунд, после чего высушите его в течение 30 секунд на бумажном полотенце за одну стирку, прежде чем поместить штифтовый инструмент в 96-луночный планшет для образцов. Через 30 секунд поднимите штифтовый инструмент прямо вверх и поместите его прямо вниз на нитроцеллюлозную мембрану на 30 секунд.

После пяти минут высыхания поместите нитроцеллюлозную мембрану в прозрачную пластиковую папку для хранения люминофорного экрана и визуализации с помощью люминофорной визуализации, как показано на рисунке.

Чтобы количественно оценить и идентифицировать потенциальные целевые белки в аналитическом программном обеспечении, связанном с люминофорным формирователем изображений, откройте файл .gel визуализированных планшетов.

Чтобы определить точки для анализа, используйте функцию "Анализ массивов", чтобы настроить сетку из 12 столбцов на 8 строк. Чтобы очертить внешний край всего пятна, определите большие круги. Экспортируйте "Объем+Фон" и "Область" определенных больших кругов в таблицу, чтобы описать маленькие внутренние точки. Уменьшите размер заданных кругов.

Экспортируйте "Объем+Фон" и "Область" определенных маленьких кругов и сохраните все данные в таблице. Расположите круги так, чтобы они перекрывались пятнами по мере необходимости, изменяя их размер, чтобы они были немного больше, чем фактические пятна.

Используйте уравнение для вычисления дробей связывания в таблице и построения графика данных. Затем определите потенциальные связывающие белки в лунках, которые демонстрируют высокие фракции связывания по сравнению с большинством других лунок.