Дифференциальное радиально-капиллярное действие лигандного анализа: высокопроизводительный метод идентификации бактериальных нуклеотидных вторичных мессенджер-связывающих внутриклеточных белков

Бактерии вырабатывают нуклеотидные вторые мессенджеры, NSM – внутриклеточные сигнальные молекулы – в ответ на соответствующие раздражители. Эти молекулы связываются с белками-мишенями и регулируют функции бактерий.

Для идентификации этих белков-мишеней с помощью дифференциального радиального капиллярного действия лигандного анализа берут многолуночный планшет с лизатом бактериальных клеток, содержащим растворимые белки. Эти белки получены из различных бактериальных клонов, экспрессирующих отдельные ORF - открытые рамки считывания - в геноме, гарантируя, что каждая лунка имеет отдельный белок.

Добавьте смесь тетра- и пентафосфатов гуанозина - НСМ, меченных радиоактивным фосфором. Эти молекулы связываются с белками-мишенями в лизате. С помощью булавочного инструмента соберите равное количество жидкости из каждой лунки. Поместите средство на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы жидкость отложилась в виде пятен.

Белки-мишени связываются с мембраной посредством нековалентных взаимодействий, предотвращая их диффузию. Это изолирует связанные радиоактивно меченые NSM в центральной точке нанесения. Свободные NSM радиально диффундируют с жидкой фазой за счет капиллярного действия.

Используйте лю