Дот-блоттинг для количественной оценки вирусного генома

Чтобы количественно определить вирусную ДНК с помощью анализа дот-блоттинга, начните с выделенной суспензии вирусной ДНК. Обработайте щелочным раствором для денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные для последующей гибридизации.

Соберите аппарат для блот-блота с предварительно смоченной капроновой мембраной. Загрузите в скважины денатурированную вирусную ДНК и линеаризованные растворы стандартной плазмидной ДНК. Примените подходящий вакуум, способствующий эффективному переносу отрицательно заряженной вирусной одноцепочечной ДНК и связыванию с положительно заряженной поверхностью мембраны посредством электростатических взаимодействий, образуя точечные узоры.

После прогона промойте мембрану буфером цитрата натрия, что поможет улучшить чувствительность анализа. После сушки подвергните мембрану воздействию ультрафиолетового света, сшивая промокаемую ДНК с мембраной.

Добавьте к мембране термически денатурированный, негетерологичный фрагмент ДНК и специфичную для вирусного генома суспензию радиоактивного зонда ДНК, меченную фосфором, в буфере для гибридизации. Инкубируют, облегчая гибридизацию.

Фрагменты ДНК действуют как блокаторы, связываясь с оставшимися участками мембраны, сводя к минимуму связывание неспецифических зондов. Радиоактивный зонд гибридизуется с комплементарной последовательностью на вирусной одноцепочечной ДНК.

Промойте с помощью промывочного буфера для удаления негибридизированных пробников. Используя систему сканирования люминофорного изображения, количественно оцените радиоактивные сигналы, излучаемые радиоактивными зондами, гибридизованными с вирусным геномом на мембране, чтобы получить сигналы точечного блоттинга.

Исходя из стандартной кривой, интенсивность сигнала каждой точки на мембране может быть использована для расчета количества вирусной ДНК в образце.

Для проведения анализа методом дот-блоттинга необходимо подготовить стандарты плазмидной ДНК путем разбавления плазмидной ДНК векторного генома AAV до 10 нанограммов на микролитр в воде или буфере Tris-HCl. Перенесите 25-микролитровую аликвоту разбавленной плазмидной ДНК в свежую пробирку и линеаризируйте ее соответствующим ферментом рестрикции в реакционном объеме 50 микролитров в течение одного часа.

Добавьте 450 микролитров воды или TE в пробирку, содержащую стандарт ДНК расщепленной плазмиды, и тщательно перемешайте. Затем перелейте 70 микролитров этой смеси в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку с 1330 микролитрами воды или TE, чтобы получить стандарт разбавленной плазмиды.

Чтобы настроить аппарат для блот-блоттинга, с помощью ножниц разрежьте промокательную мембрану до размера, соответствующего количеству проб и стандартам. Замочите мембрану водой на 10 минут, перед тем как поместить ее на аппарат dot blot. Затем закройте неиспользуемые лунки. Добавьте воду в колодцы, в которые будут загружаться пробы. Примените вакуум, протяните воду через лунки, проверьте наличие ошибок, а затем снова закрутите винты. При необходимости повторите тест.

Нанесите по 400 микролитров каждого стандарта разведенной плазмидной ДНК в каждую лунку и запустите четыре полосы стандартных разведений. Используйте две отдельные аликвоты стандартного дайджеста, и загрузите каждую в двух экземплярах. Затем внесите 200 микролитров в лунку каждого образца вирусной ДНК. Примените мягкий вакуум, чтобы объединить растворы ДНК через лунки. Затем, когда все лунки опустошены, выпустите вакуум, отрегулировав трехходовой клапан.

Добавьте в каждую лунку по 400 микролитров щелочного раствора 1Х. Затем подождите пять минут, прежде чем снова нанести вакуум, чтобы опорожнить лунки. Снова нанесите вакуум и разберите аппарат для блот-блота. Затем снимите мембрану и промойте ее 2X SSC.

Поместите мембрану на чистое бумажное полотенце стороной, связанной с ДНК, вверх, чтобы удалить излишки буфера. Используйте соответствующий УФ-сшивающий агент для УФ-сшивания блотированной ДНК с мембраной. Теперь мембрана готова к гибридизации.

Поместите мембрану в бутылку для гибридизации стороной вверх, связанной с ДНК. Промойте мембрану от 5 до 10 миллилитров предварительно подогретого буфера для гибридизации и выбросьте буфер. Затем добавьте 10 миллилитров предварительно подогретого буфера для гибридизации и поместите бутылку во вращающуюся гибридизационную печь, установленную на 65 градусов по Цельсию. Вращайте бутылку не менее пяти минут.

Быстро добавьте денатурированную ДНК сперматозоида и радиоактивный зонд в буфер для гибридизации в бутылке и встряхните его в течение 10 секунд для смешивания. Верните бутылку в духовку с температурой 65 градусов Цельсия и выдержите ее при вращении при температуре 65 градусов Цельсия не менее четырех часов.

После завершения гибридизации остановите вращение, извлеките бутылку для гибридизации, а затем налейте раствор радиоактивного зонда в 50-миллилитровую коническую пробирку с герметичной заглушкой. Чтобы промыть мембрану, добавьте от 20 до 30 микролитров предварительно подогретого буфера для промывки в бутылку для гибридизации и вращайте ее в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.

После третьей промывки снимите мембрану с флакона для гибридизации, а с помощью бумажных полотенец удалите излишки буфера с мембраны. Затем поместите мембрану в прозрачный пластиковый держатель для бумаги. С помощью счетчика Гейгера проверьте радиоактивные сигналы на мембране.

[ТРЕП]

После того, как стертый люминофорный экран будет подвержен воздействию мембраны, отсканируйте экран с помощью системы сканирования люминофорного изображения и получите данные об интенсивности сигнала каждой точки.