Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия для изучения гомоолигомеризации белков

Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия позволяет определить состояние олигомеризации белков в образце.

Для начала возьмем предметное стекло в камере, содержащее флуоресцентно меченный раствор белкового мономера. Поместите предметное стекло под конфокальный микроскоп. Сфокусируйте лазерный луч на небольшой части образца — конфокальный объем — чтобы возбудить белковые мономеры.

Молекулы белка диффундируют внутрь и из конфокального объема за счет броуновского движения. Это движение вызывает быстрые изменения интенсивности флуоресценции, что приводит к колебаниям интенсивности флуоресценции с течением времени.

Добавьте димеризующий агент — бивалентный лиганд, который помогает двум белковым мономерам связываться и, таким образом, образовывать димер. Из-за димеризации две флуоресцентные метки объединяются в одну частицу, что увеличивает интенсивность флуоресценции на частицу — молекулярную яркость.

Увеличение молекулярной яркости за счет димеризации увеличивает амплитуду флуктуаций флуоресценции — так как две флуоресцентные метки входят в конфокальный объем и покидают его вместе.

Получение изображений конфокального объема во времени до и после добавления димеризующего агента.

Вычисл