Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия для изучения гомоолигомеризации белков

Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия позволяет определить состояние олигомеризации белков в образце.

Для начала возьмем предметное стекло в камере, содержащее флуоресцентно меченный раствор белкового мономера. Поместите предметное стекло под конфокальный микроскоп. Сфокусируйте лазерный луч на небольшой части образца — конфокальный объем — чтобы возбудить белковые мономеры.

Молекулы белка диффундируют внутрь и из конфокального объема за счет броуновского движения. Это движение вызывает быстрые изменения интенсивности флуоресценции, что приводит к колебаниям интенсивности флуоресценции с течением времени.

Добавьте димеризующий агент — бивалентный лиганд, который помогает двум белковым мономерам связываться и, таким образом, образовывать димер. Из-за димеризации две флуоресцентные метки объединяются в одну частицу, что увеличивает интенсивность флуоресценции на частицу — молекулярную яркость.

Увеличение молекулярной яркости за счет димеризации увеличивает амплитуду флуктуаций флуоресценции — так как две флуоресцентные метки входят в конфокальный объем и покидают его вместе.

Получение изображений конфокального объема во времени до и после добавления димеризующего агента.

Вычислите яркость отдельных пикселей на конфокальных изображениях и получите кривую средней яркости с течением времени.

Добавление димеризующего агента приводит к двукратному увеличению яркости за счет двойных сигналов флуоресценции от каждой частицы, при этом общее количество молекул белка остается прежним, что указывает на образование димеров.

Чтобы настроить многолуночный планшетный массив, сначала приготовьте раствор 100 наномолярного очищенного FKBP12 в том же буфере, который использовался для эксклюзионной хроматографии. Ультразвуковая обработка и центрифуга с быстрым вращением 13 000 об/мин для предотвращения образования заполнителей.

Теперь пипеткой нанесите от 100 до 200 микролитров разведенного белка в 8-луночную камеру наблюдения со стеклянным дном. Добавьте димеризатор BB до конечных концентраций 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 и 500 наномоляров. В качестве образца приготовьте раствор только из 100 наномолярных мВенер для оценки потенциальных эффектов агрегации и осаждения, а также для восстановления значения яркости для мономера с теми же настройками регистрации.

Может быть использована любая конфокальная система светового сканирующего микроскопа, оснащенная цифровыми детекторами или хорошо охарактеризованными аналоговыми детекторами и способная поддерживать постоянное время пребывания для каждого полученного пикселя. Выберите корректирующий объектив для коррекции воды с помощью кольца, предназначенный для флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

Теперь добавьте каплю воды в цель коррекции воротника для погружения в воду. Установите на сцену камеру наблюдения на 8 лунок. Задайте траекторию луча возбуждения, включив 514-нанометровый лазер и установив его мощность от 20 до 100 нановатт на выходе из объектива. Включите один HyD-датчик. Предпочтительны детекторы, способные подсчитывать фотоны. Выберите окно излучения от 520 до 560 нанометров.

Для режима съемки используйте формат 16 на 16 пикселей.

Установите время задержки пикселей таким образом, чтобы время кадра было больше, чем диффузия белка, а время задержки пикселей было намного короче. Это соответствовало установке времени задержки примерно в 13 микросекунд для системы, использованной в этой демонстрации.

Установите отверстие на одну единицу Эйри для соответствующего излучения примерно 545 нанометров. Выберите режим сбора данных xy-время и выберите количество кадров, которые должны быть получены для одного захвата и скважины. Теперь установите размер пикселя примерно на 120 нанометров.

Если система оснащена высокопроизводительным режимом, введите координаты каждой скважины, а также количество заборов на скважину для автоматизации процесса. Если система оснащена системой перфузии, загрузите раствор BB и запрограммируйте перфузию на запуск сразу после 5 000-го кадра, чтобы оценить кинетику димеризации при получении 10 000 изображений.

Выберите правильную скважину и сосредоточьтесь на решении. Затем запустите получение изображения и сохраните полученную стопку изображений в формате TIFF.