Анализ in vitro на основе SELEX для выявления РНК-белковых взаимодействий

Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения, SELEX, позволяет идентифицировать последовательности РНК, связывающие белки.

Во-первых, получить рандомизированный пул РНК, содержащий радиоактивно меченые РНК с рандомизированными последовательностями, которые сворачиваются в высокоспецифичные структуры. Инкубируйте с целевым белком. Белок связывается с молекулами РНК со специфическими последовательностями и трехмерными структурами, в то время как неспецифические РНК остаются несвязанными.

Пропустите смесь через нитроцеллюлозный фильтр. Несвязанная РНК проходит через фильтрующие поры, в то время как РНК-белковые комплексы остаются сохраненными.

Измельчите фильтр, содержащий РНК-белковый комплекс, на фрагменты. Повторите взаимодействие РНК-белка путем инкубации пула РНК с пониженной концентрацией целевого белка, что позволяет связываться только с высокоаффинными последовательностями, в то время как низкоаффинные последовательности не связываются.

Загрузите эту смесь на полиакриламидный гель и проведите электрофорез. РНК-белковые комплексы медленно мигрируют через гель по сравнению с низкоаффинными, несвязанными РНК. Рентгеновская визуализация геля показывает сдви