Анализ in vitro на основе SELEX для выявления РНК-белковых взаимодействий

Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения, SELEX, позволяет идентифицировать последовательности РНК, связывающие белки.

Во-первых, получить рандомизированный пул РНК, содержащий радиоактивно меченые РНК с рандомизированными последовательностями, которые сворачиваются в высокоспецифичные структуры. Инкубируйте с целевым белком. Белок связывается с молекулами РНК со специфическими последовательностями и трехмерными структурами, в то время как неспецифические РНК остаются несвязанными.

Пропустите смесь через нитроцеллюлозный фильтр. Несвязанная РНК проходит через фильтрующие поры, в то время как РНК-белковые комплексы остаются сохраненными.

Измельчите фильтр, содержащий РНК-белковый комплекс, на фрагменты. Повторите взаимодействие РНК-белка путем инкубации пула РНК с пониженной концентрацией целевого белка, что позволяет связываться только с высокоаффинными последовательностями, в то время как низкоаффинные последовательности не связываются.

Загрузите эту смесь на полиакриламидный гель и проведите электрофорез. РНК-белковые комплексы медленно мигрируют через гель по сравнению с низкоаффинными, несвязанными РНК. Рентгеновская визуализация геля показывает сдвиг полосы, соответствующий расположению комплекса РНК-белок.

Нарежьте комплексосодержащую гелевую порцию. Добавьте протеиназу К к фрагментам фильтра и срезам геля, расщепляя белки и высвобождая РНК из комплекса. Добавьте фенол-хлороформ и центрифугу, отделяя РНК от переваренных белков.

Смешайте РНК-содержащую надосадочную жидкость с ацетатом натрия и этанолом. Центрифуга для осаждения РНК. Ресуспендировать в воде, не содержащей РНКазы. Обратная транскрибация РНК для комплементарной ДНК и ПЦР-амплификация ДНК.

Повторите несколько раундов разделения на основе фильтра и геля для получения пула целевых белково-специфичных последовательностей ДНК.

Чтобы связать белок и РНК в реакционном объеме 100 мкл, сначала готовят 10 мкмольярный трис-гидрохлорид при рН 7,5, содержащий 50 ммилляр хлорида калия, один миллимолярный DTT, 0,09 мкг на микролитр бычьего сывороточного альбумина, 0,5 мкг на микролитр РНКсина, 0,15 мкг на микролитр тРНК и 1 миллимолярный ЭДТА. Затем добавьте 30 микролитров рекомбинантного белка PTB и 10 микролитров РНК из соответствующего пула.

Поместите пробирки, содержащие реакции связывания, в температурный блок примерно на 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Затем фракционируйте связанную РНК из несвязанной РНК с помощью четырех раундов отбора и амплификации. Сначала отфильтруйте образец объемом 100 микролитров при комнатной температуре через нитроцеллюлозный фильтр, прикрепленный к вакуумному коллектору. Комплекс РНК-белок остается на фильтре.

Стерильным лезвием бритвы разрежьте фильтр на осколки и вставьте их в центрифужную пробирку. Погрузите части фильтра в буфер протеиназы К и поместите его в стакан минимум на три часа или на ночь, чтобы восстановить РНК.

Для депротеинизации образца РНК добавляют равный объем фенол-хлороформа, вихря. А затем центрифугировать на высокой скорости в течение пяти минут при комнатной температуре. Получить водную фазу, и снова экстрагировать хлороформом. После этого смешайте надосадочную жидкость с 1/10 объемом 3 моляров ацетата натрия при pH 5,2 и двумя-тремя объемами абсолютного этанола.

Оставьте пробирку в морозильной камере при температуре -80 градусов Цельсия на 30 минут, а затем центрифугируйте ее на высокой скорости в течение 10 минут. Повторите этапы промывки и сушки с 70% этанолом и растворите РНК в воде, обработанной DEPC. После первого раунда фильтросвязывающего анализа проведите еще три обхода.

Затем выполните два раунда транскрипции, связывания и амплификации, чтобы отделить связанные с белком фракции РНК от несвязанных. Предварительно нанесите нативный 5% полиакриламидный гель с соотношением бисакриламида 60 к 1 в буфере 0,5x TBE. Затем запустите реакцию связывания РНК-белка.

Поместите гель в устройство для электрофореза, заполненное 0,5x буфером TBE, в холодное помещение при температуре 4 градуса Цельсия. Подайте напряжение 250 вольт на 15 минут, и проведите пипеткой реакцию связывания в разные лунки. Затем, далее, фракционируйте связанную РНК из несвязанной РНК, запустив электрофорез при напряжении 250 вольт в течение одного-двух часов.

Далее подвергните гель рентгеновской пленке и определите расположение связанной РНК с помощью авторадиографии. Вырежьте гелевый срез со связанной РНК и вставьте его в пробирку. Измельчите срез геля и инкубируйте в буфере протеиназы К в течение трех часов или в течение ночи. Повторите экстракцию фенол-хлороформом и хлороформом, как описано ранее. Синтезировать кДНК из растворенной РНК.

Приготовьте 20 микролитров реакции, включая два микролитра 10-кратного RT-буфера, два микролитра обратной транскриптазы AMV, 1 микролитр обратного праймера, 5 микролитров воды и 10 микролитров растворенной РНК. Выдерживать при температуре 42 градуса Цельсия в течение 60 минут.

Амплифицируйте кДНК с помощью от 20 до 25 циклов ПЦР, как описано ранее. Повторите процесс синтеза РНК, связывания белка и разделения связанных с белком и несвязанных фракций.