Микроскопия TIRF для визуализации динамики связи актина и микротрубочек

Актиновые мономеры полимеризуются по принципу «голова к хвосту», образуя тонкие волокна, называемые микрофиламентами. Аналогичным образом, тубулиновые димеры полимеризуются в более длинные полые цилиндрические микротрубочки. Эти компоненты цитоскелета поддерживают форму клеток и способствуют клеточной подвижности.

Для визуализации динамики связи актина и микротрубочек с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) требуется специальная сборка для визуализации.

Узел визуализации состоит из двух покровных стекол: верхнего покровного стекла с силановым покрытием m-PEG и нижнего покровного стекла с силановым покрытием biotin-PEG. Два покровных стекла расположены в продольном направлении с помощью двусторонней клейкой ленты и герметизированы с обоих концов для создания проточного канала.

Внесите пипетку BSA в проточный канал для заполнения камеры. Добавьте раствор стрептавидина, и инкубируйте. Молекулы стрептавидина связываются с молекулами биотина, прикрепленными к ПЭГ-силану нижней крышки.

Подайте буфер TIRF в канал. Добавьте раствор смеси цитоскелета, содержащий немеченные и зеленые димеры тубулина, меченные флуорофорами, а также немеченые, меченные биотином и фиолетовые мономера актина.

Далее добавляют реакционный раствор, содержащий АТФ — агент, стимулирующий полимеризацию актина, и ГТФ — агент, стимулирующий полимеризацию тубулина, и белок, связывающий актин с микротрубочками. Инкубировать.

Димеры тубулина связываются с молекулами ГТФ и полимеризуются, в то время как мономера актина связываются с молекулами АТФ и полимеризуются, образуя микротрубочки и микрофиламенты соответственно.

Поместите узел визуализации под микроскоп TIRF. Возбуждайте флуорофоры лазерами соответствующей длины волны.

Возбуждающий свет отражается изнутри и создает световое поле, которое избирательно освещает флуорофоры в ограниченной области вблизи границы раздела стекло-вода, где есть две среды с разными показателями преломления. В этой области микроволокна кажутся фиолетовыми, а микротрубочки – зелеными.

Отрежьте 12 полос двустороннего скотча с двусторонней поддержкой, длиной 24 миллиметра. Снимите одну сторону подложки для ленты и закрепите куски ленты рядом с шестью канавками на чистой камере визуализации. Снимите второй кусок подложки для ленты, чтобы обнажить липкую сторону ленты вдоль каждой канавки камеры, и поместите камеру стороной ленты вверх на чистую поверхность.

Смешайте растворы эпоксидной смолы и отвердителя один к одному в небольшой лодке для взвешивания и с помощью наконечника P1000 поместите каплю смешанной эпоксидной смолы между полосками ленты в конце каждой канавки камеры визуализации. Затем положите камерный скотч или эпоксидную сторону вверх на чистую поверхность.

Извлеките покровное стекло с покрытием из инкубатора при температуре 70 градусов Цельсия и шесть раз промойте поверхности покровных стекол с покрытием и без покрытия водой двойной дистилляции. Высушите отфильтрованным азотом, а затем прикрепите к камере визуализации стороной покровного стекла по направлению к ленте.

С помощью наконечника для дозатора P200 или P1000 надавите на границу между лентой и стеклом, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между лентой и покровным стеклом. Инкубируйте собранные камеры при комнатной температуре в течение не менее пяти-10 минут, чтобы эпоксидная смола полностью герметизировала стенки камеры перед использованием.

Срок годности перфузионных камер истекает через 12–18 часов после сборки. Используйте перфузионный насос и последовательно обменивайте кондиционирующие растворы в перфузионной камере, подавая 50 микролитров 1% BSA для заполнения камеры визуализации.

Снимите лишний буфер с фитингового бачка Luer-lock. Затем налейте 50 микролитров стрептавидина 0,005 миллиграмма на миллилитр и инкубируйте в течение одной-двух минут при комнатной температуре. Удалите лишний буфер из резервуара.

Налейте 50 микролитров 1% BSA, чтобы блокировать неспецифическое связывание, и инкубируйте от 10 до 30 секунд. Удалите лишний буфер из резервуара. Далее влейте 50 микролитров теплого 1x TIRF буфера, а затем 50 микролитров стабилизированных, и 50% биотинилированных семян микротрубочек, разведенных в 1x TIRF буфере.

Установите нагреватель предмета или объектива на поддержание температуры от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, прежде чем произойдет первая биохимическая реакция. Затем установите интервал сбора данных каждые пять секунд в течение 15–20 минут. Затем установите 488 и 647-лазерное воздействие на 50-100 миллисекунд при мощности от 5% до 10%, предварительно отрегулировав реакцию полимеризации для запуска сборки актиновой нити.

Получите изображения с точностью до 647 нанометров и внесите соответствующие корректировки. Затем отрегулируйте реакцию полимеризации во второй кондиционированной перфузионной лунке, чтобы инициировать сборку микротрубочек. Визуализируйте изображение на 488 нанометрах и внесите соответствующие корректировки.

Соедините три микролитра 10-микролярного 488-тубулина с 7,2 микролитрами 100 микромольного флуоресцентного немеченного тубулина не более чем за 15 минут до применения. Затем соедините три микролитра разбавленного биотинилированного актина в соответствующих объемах флуоресцентно немеченного и меченого актина таким образом, чтобы окончательная смесь составила 12,5 микромолярного общего актина с 10% до 30% флуоресцентной меткой.

Приготовьте смесь цитоскелета, соединив два микролитра 12,5-микромолярной смеси актина с тубулиновой смесью, не более чем за 15 минут до визуализации. Хранить на льду до использования.

Приготовьте белковую реакционную смесь, объединив все другие экспериментальные компоненты и белки, включая 2x буфер TIRF, антиотбеливатель, нуклеотиды, буферы и вспомогательные белки. Инкубируйте смесь цитоскелета в белковой реакционной смеси отдельно, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–60 секунд.

Чтобы инициировать реакцию, добавьте содержимое белковой реакционной смеси в смесь цитоскелета и перемешайте ее. В перфузионную камеру подается 50 микролитров реакционной смеси, содержащей 1x буфер TIRF с добавлением 15 микромолярного свободного тубулина, одного миллимолярного ГТФ, 0,5 микромолярных актиновых мономеров и соответствующие объемы буферного контроля.

Записывайте цейтраферный видеоролик с помощью программного обеспечения микроскопа каждые пять секунд в течение 15–20 минут. Хорошо кондиционируйте новую перфузию и замените объем буфера на интересующий вас регуляторный белок и буферный контроль. Получить для оценки регуляторных белков для эмерджентных функций актиновых микротрубочек.