Решетчатая световая микроскопия для визуализации рецептор-лигандных взаимодействий в живых клетках

Решетчатая световая листовая микроскопия, LLSM, позволяет визуализировать взаимодействия рецептор-лиганд между клеткой и поверхностью клетки в живых клетках с высоким пространственно-временным разрешением.

Возьмите покровный лист, содержащий трансдуцированные лиганд-экспрессирующие клетки, излучающие красную флуоресценцию. Прикрепите покровное стекло ячейкой вверх к смазанному маслом держателю образцов. Закрепите держатель на пьезоэлементе предметного столика микроскопа, чтобы обеспечить точное позиционирование образца и сканирование во время визуализации. Отрегулируйте настройки программного обеспечения, чтобы сосредоточиться на одной клетке, экспрессирующей лиганд.

Пипеткой нанесите рецептор-экспрессирующую клеточную суспензию на покровное стекло. Рецепторы помечены зелеными антителами, меченными флуорофорами. Представьте взаимодействующие пары клеток.

Возбуждающий лазер микроскопа излучает круговой лазерный луч с линейной поляризацией, который проходит через цилиндрические линзы, создавая световой слой. Световой слой проецируется на модулятор, который удаляет излишнюю дифракцию и преобразует ее в ультратонкую решетчатую структуру.

Решетчатый световой слой освещает ультратонкий участок взаимодействующей пары ячеек, а флуоресценция, излучаемая взаимодействующими ячейками, захватывается перпендикулярно падающему лучу. Визуализируйте взаимодействующую пару ячеек в нескольких Z-плоскостях и получайте двумерные изображения в каждой фокальной плоскости с помощью высокоскоростной камеры.

Используя подходящее программное обеспечение, объедините эти изображения, чтобы сформировать z-стек — четырехмерное изображение с высоким разрешением, демонстрирующее пространственно-временную динамику взаимодействия рецептора и лиганда на клеточной поверхности.

Добавьте в ванну LLSM 10 миллилитров воды и 30 микролитров флуоресцеина. Сначала нажмите Image (Home), чтобы переместить объект в положение изображения, и посмотрите на диаграмму направленности лазерного луча одного сосуда.

Выровняйте лазерный луч с помощью направляющей и предустановленной области интереса, чтобы луч представлял собой тонкую структуру, сбалансированную во всех направлениях. Луч также должен казаться сфокусированным в камере видоискателя. Используйте два регулятора наклона зеркала, верхний фокусный микрометр и цвет объектива для регулировки луча.

Затем промойте ванну и объективы не менее чем 200 миллилитрами воды, чтобы полностью удалить любой флуоресцеин.

Чтобы отобразить стандартные флуоресцентные шарики, включите дизеринг, установив значение 3 в поле «X Galvo Range», и нажмите «Live» для просмотра текущего поля. Вручную отрегулируйте наклонное зеркало, цвет объектива и микрометр фокусировки для получения максимальных значений серого. Затем отрегулируйте по мере необходимости, чтобы получить правильные шаблоны для режимов сканирования объектива, Z galvo, Z plus objective и сканирования образца. После этого нажмите кнопку «Выполнить» в режиме сканирования образца, чтобы собрать данные о функции разброса точки выборки для устранения перекоса и свертки. Переключите лазеры в трехцветный режим и снова нажмите Execute

Для начала добавьте 100 000 антигенпрезентирующих клеток в подготовленную круглую покровную крышку диаметром 5 мм и дайте им отстояться в течение 10 минут. Смажьте держатель образца маслом и прикрепите к нему покровное стекло клеточной стороной вверх.

Затем добавьте каплю носителя для изображения на обратную сторону покровного стекла. Накрутите держатель образца на пьезо и нажмите Image (Home). Найдите антигенпрезентирующую клетку для визуализации и убедитесь, что LLSM и программное обеспечение для визуализации работают должным образом.

Нажмите «Онлайн», чтобы просмотреть текущее изображение. Двигайтесь по Z, чтобы найти покровную крышку и ячейки. Найдите центр антигенпрезентирующей клетки, двигаясь в направлении Z, затем нажмите Stop, чтобы приостановить лазер. Проверьте 3D и введите желаемые настройки. Нажмите Enter, а затем нажмите Execute для сбора данных.

Опустите предметный столик в положение «Загрузить» и добавьте 50 микролитров Т-клеток в носители для визуализации по каплям непосредственно на покровное стекло. Лучше всего дать капле образоваться на конце наконечника пипетки, а затем прикоснуться кончиком к жидкости для ванны. Поднимите сцену назад, нажав кнопку Изображение (Return).

Начните визуализацию. Обязательно установите желаемый Z-стек и длину таймлапса. Например, представьте себе 60 Z-стеков с шагом 0,4 микрометра и введите 500-е временные рамки. Остановите запись до достижения 500 кадров, чтобы избежать фотообесцвечивания. Используйте режим Live для поиска пар ячеек, а когда готовые и желаемые настройки будут введены, нажмите Execute для сбора данных.