Темнопольная микроскопия для визуализации диффузионной динамики наностержней на клеточной мембране

Чтобы исследовать диффузионную динамику золотых наностержней на мембране живой клетки с помощью темнопольной микроскопии, DFM в сочетании с отслеживанием одиночных частиц начинают с стерилизованного покровного стекла в чашке для культивирования, содержащей подходящую среду. Добавьте суспензию ячеек на покровное стекло. Среда способствует росту клеток.

Инкубируйте с положительно заряженными золотыми наностержнями, которые адсорбируются на отрицательно заряженной клеточной мембране посредством электростатических взаимодействий. Пипеткой наведите среду из чашки в углубление предметного стекла. Поместите покровное стекло ячейкой вниз на паз и запечатайте.

Поместите предметное стекло на предметный столик для темнопольного микроскопа. Микроскоп освещает образец высокоугловым косым светом, проходящим через специализированный темнопольный конденсатор.

При освещении наностержней свободные электроны на поверхности наностержней колеблются с частотой, резонансной с падающим светом. Колеблющиеся электроны рассеивают свет на определенной длине волны, захваченной линзой объектива, что позволяет визуализировать наностержни.

Точно так же клеточная мембрана, состоящая из липидов и белков, рассеивает падающий свет с более высоким показателем преломления, чем окружающая среда, создавая яркое изображение на темном фоне. Захват изображений DFM с временными рядами.

Используя подходящее программное обеспечение, выполните анализ отслеживания отдельных частиц на изображениях DFM, чтобы визуализировать диффузию наностержней через клеточную мембрану с высоким пространственно-временным разрешением.

Начните с того, что сожгите на пламени стеклянную защитную крышку, покрытую этанолом, и поместите ее в чашку для клеточных культур размером 35 на 10 миллиметров, содержащую 2 миллилитра среды для клеточных культур без фенольного красного. Добавьте 50 микролитров интересующей клеточной суспензии на покровную крышку и осторожно встряхивайте чашку вперед и назад, влево и вправо, чтобы равномерно распределить клетки.

Поместите чашку в инкубатор для клеточных культур примерно на 12 часов, пока слияние клеток не достигнет 20–40%, прежде чем добавлять в чашку 20 микролитров золотых наностержней с покрытием CTAB. После легкого встряхивания наностержней равномерно распределить их по чашке, поместите чашку во влажную атмосферу на 5 минут.

В конце инкубации медленно перенесите 100 микролитров надосадочной жидкости из чашки в углубление стеклянного предметного стекла и осторожно положите покровное стекло ячейкой вниз на предметное стекло. Затем заклейте край покровного стекла лаком для ногтей и дайте лаку высохнуть, прежде чем поместить предметное стекло на предметный столик для темного микроскопа.

Для отслеживания отдельных частиц с помощью темнопольной микроскопии поместите каплю масла на погружной в масло темнопольный конденсатор и поворачивайте ручку до тех пор, пока конденсор не соприкоснется со стеклянным предметным стеклом. Капните каплю масла на верхнюю часть защитного стекла и поворачивайте ручку фокусировки до тех пор, пока объектив с 60-кратным погружением в масло не коснется масла.

Включите источник света и слегка поверните ручку фокусировки, чтобы сфокусировать плоскость изображения. Затем нажмите на значок камеры в программном обеспечении микроскопа, чтобы записать временной ряд изображения рассеяния света с помощью цветной CMOS-камеры и сохранить изображение в формате TIFF.

Чтобы извлечь одну долгосрочную траекторию, откройте изображение в ImageJ и нажмите Изображение | Тип | и 8-бит, чтобы преобразовать изображение из режима RGB в 8-битный режим. Чтобы настроить контрастность, нажмите Изображение | Настройка | Яркость | Контрастность и задайте параметры. Выберите целевую частицу и с помощью клавиш "Control + X" отсечь фон временного ряда.

Нажмите Plug-ins | Particle Tracker Classic | и Particle Tracker, чтобы открыть окно обнаружения частиц и связывания частиц и установить радиус равным 6, порог равным 0 и процентиль равным 0,01%. Установите диапазон связи на 10 и смещение на 10 и нажмите «ОК», чтобы открыть окно результатов трекера частиц и увидеть результаты.

Нажмите «Визуализировать все траектории», чтобы просмотреть сгенерированные траектории. Если сгенерированная программным обеспечением траектория и траектория движения золотых наностержней совпадают, нажмите «Сохранить полный отчет», чтобы сохранить результаты. Если сгенерированная программным обеспечением траектория не совпадает с траекторией движения золотых наностержней, нажмите «Повторно связать частицы», чтобы повторно связать обнаруженные частицы с разным диапазоном связи и процентильными параметрами.