Просвечивающая электронная микроскопия для количественной оценки распределения гликогена в скелетных мышцах человека

Гликоген, разветвленный полимер глюкозы, является энергетическим резервом в субклеточных межмиофибриллярных, внутримиофибриллярных и субсарколеммальных компартментах скелетных мышц человека.

Для количественной оценки субклеточного распределения гликогена с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) получают изолированную скелетную мышечную ткань человека. Закрепить глутаральдегидом для сохранения структуры тканей. Постфиксируйте ткань в растворе тетраоксида осмия и ферроцианида калия.

Восстановленный комплекс осмий-ферроцианид связывается с гидроксильными группами в гликогене, улучшая контраст частиц гликогена в мышцах. Кроме того, окрашиваются мембраны и саркоплазматический ретикулум — мембраносвязанная органелла.

Обезвоживайте ткани при повышении концентрации этанола. Заделывают в смолу, формируя твердый блок. Получить ультратонкие срезы с продольно ориентированными мышечными волокнами; перенос на сетки ПЭМ.

Погрузите решетки в раствор уранилацетата, тяжелого металла. Ионы уранила связываются с отрицательно заряженными липидами и белками, делая их электронно-плотными. Окрасить раствором цитрата свинца.

Ионы свинца связываются с окрашенными осмием областями, включая частицы гликогена, усиливая контраст. Они также связываются с областями, с которыми прореагировал уранилацетат, усиливая электронную непрозрачность

Во время ПЭМ-визуализации, когда электронные пучки проходят через ткань, окрашенные электронно-плотные области, включая гликоген, рассеивают больше электронов, в то время как неокрашенные области пропускают электроны.

На высококонтрастном изображении ПЭМ частицы гликогена кажутся отчетливыми и темными; неокрашенные участки кажутся светлее, что облегчает визуализацию и количественную оценку субклеточного распределения гликогена в мышцах.

Выделите небольшой образец из биопсии мышцы или целой мышцы, который имеет максимальный диаметр 1 миллиметр в любом направлении и длиннее в продольном, чем в поперечном сечении.

Поместите образец в пробирку с холодным раствором для первичной фиксации. Храните его при температуре 5 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем промойте образец 4 раза в 0,1 молярном буфере какодилата натрия. С помощью переводных пипеток извлеките использованный буфер из пробирки, оставив образец нетронутым, и добавьте свежий буфер. После этого зафиксируйте образец 1% тетраоксидом осмия и 1,5% ферроцианидом калия в 0,1 молярном буфере какодилата натрия на 120 минут при 4 градусах Цельсия.

Дважды промойте образец в воде двойной дистилляции комнатной температуры. Обезвоживайте путем погружения в поэтапный ряд этанола при комнатной температуре. Инфильтрируйте образец смесями оксида пропилена и эпоссидовой смолы при комнатной температуре, используя указанные объемные соотношения.

На следующий день поместите образцы в 100% свежую эпоссидическую смолу в формы и полимеризуйте при температуре 60 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Установите блок образца на держатель ультрамикротома. Обрежьте блок на поверхности лезвием бритвы до уровня ткани. Установите алмазный нож перед образцом и выровняйте поверхность образца параллельно ножу.

Изготовьте полутонкий срез толщиной 1 микрометр с помощью алмазного ножа, чтобы проверить ориентацию образца. Окрасьте полутонкий срез толуидиновым синим для наблюдения с помощью световой микроскопии. Затем обрежьте блок еще больше, чтобы уменьшить интересующую область и получить правильные ультратонкие секции.

Вырежьте ультратонкие срезы толщиной от 60 до 70 нанометров с помощью второго алмазного ножа. Соберите от 1 до 2 секций на медных сетках с одним отверстием с помощью Perfect Loop. Для контрастирования участков погрузите сетки в раствор уранилацетата на 20 минут, а сетки промойте в воде двойной дистилляции, а затем погрузите решетки в цитрат свинца на 15 минут, а сетки повторно промойте в воде двойной дистилляции.

Включите просвечивающий электронный микроскоп, компьютер и программное обеспечение для записи изображений. Записывайте цифровые изображения с помощью цифровой ПЗС-камеры с медленным сканированием и соответствующего программного обеспечения для обработки изображений. После вставки сетки с несколькими срезами в предметный столик микроскопа сначала экранируйте сетку при малом увеличении, чтобы выбрать срезы наилучшего качества и определить направление мышечных волокон.

Затем сфокусируйте изображение при увеличении выше 30 000, при этом луч будет центрирован на периферийном волокне в этом сечении, и запишите изображения с выдержкой 1 секунда при желаемом увеличении. Убедитесь, что изображения распределены по длине и ширине волокна в случайном, но систематическом порядке для получения объективных результатов, и повторяйте визуализацию до тех пор, пока не будет получено изображение от 6 до 10 волокон.

Импортируйте изображения в imageJ, нажав «Файл», а затем «Открыть». Установите глобальный масштаб в соответствии с исходным размером изображения, нажав «Анализ», а затем «Установить масштаб». Чтобы увеличить масштаб на 100%, нажмите на «Изображение», перейдите в «Масштаб» и нажмите «В».

Измерьте толщину одного Z-диска для каждого изображения миофибриллярного пространства с помощью инструмента «Прямая линия» в меню «Инструменты» и рассчитайте среднюю толщину Z-диска каждого из 6–10 волокон. С помощью инструмента Сегментированная линия (Segmented Line) измерьте длину самой внешней миофибриллы, видимой чуть ниже субсарколеммальной области.

Чтобы вставить сетку, нажмите «Анализ», выберите «Инструменты», а затем выберите «Сетка». Теперь установите Площадь на точку на 32 400 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий в пределах доступной длины на 12 субсарколеммальных изображениях, где крест попадает на субсарколеммальный гликоген.

Вставьте сетку, нажав на кнопку «Анализ», затем выберите «Инструменты», затем «Сетка» и установите площадь на точку на уровне 160 000 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий в 12 миофибриллярных изображений, где крестик попадает во внутримиофибриллярное пространство.

Затем снова, чтобы вставить сетку, нажмите «Анализ», выберите «Инструменты», а затем выберите «Сетка». Теперь установите Площадь на точку на 3 600 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий в 12 миофибриллярных изображениях, где крестик попадает на интрамиофибриллярный гликоген.

Вставьте сетку, нажав на кнопку «Анализ», затем выберите «Инструменты», затем «Сетка» и установите площадь на точку на уровне 32 400 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий в 12 миофибриллярных изображениях, где крестик попадает на интермиофибриллярный гликоген.

Используя сетку площадью 32 400 квадратных нанометров для случайного выбора частиц гликогена, начните с верхнего левого квадрата и при необходимости двигайтесь влево. С помощью инструмента «Прямая линия» измерьте диаметр 5 случайно выбранных частиц гликогена каждого бассейна для каждого из 12 изображений, чтобы получить в среднем 60 частиц на бассейн на волокно.