Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для выявления множественных фосфорилирований в белках

Многократное фосфорилирование в белке включает добавление фосфатных групп к белку в различных положениях, в частности, в остатках серина и треонина.

Чтобы идентифицировать множественные фосфорилирования в белке, начните с пробирки, содержащей фосфорилированные белки, меченные азотом-15, что помогает дифференцировать амидные водороды от других атомов водорода в белке.

Добавьте внутреннее эталонное соединение ЯМР для точного измерения относительных резонансных частот. Перенесите смесь в трубку ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Вставьте трубку во вращающуюся апертуру и поместите ее в ЯМР-спектрометр.

Присутствие фосфатов проявляет электрон-акцепторные эффекты в фосфорилированных остатках серина и треонина. В результате, амидные водороды фосфорилированных остатков, по-видимому, деэкранированы с меньшей электронной плотностью по сравнению с другими амидными водородами.

Амидные водороды с различными электронными средами испытывают дифференциальные магнитные поля вокруг ядер, достигая низкоэнергетических состояний.

Подайте короткий радиочастотный импульс, чтобы возбудить ядра водорода до более высокого энергетического состояния на определенной резонансной частоте, основанной на их электронном окружении.

Во время релаксации ядра возвращаются в низкоэнергетическое состояние, высвобождая поглощенную энергию, которая, как обнаруживается, производит сигнал ЯМР.

Построение двумерного спектра ЯМР, представляющего отдельные амидные водороды.

Сравните спектр фосфорилированного белка с спектром нефосфорилированного белка. Появление дополнительных резонансов в спектре ЯМР фосфорилированного белка подтверждает множественные фосфорилирования.

Растворите 4 миллиграмма лиофилизированного ¹⁵N и ¹³C обогащенного ERK-фосфорилированного тау в 400 микролитрах ЯМР-буфера. Добавьте 5% оксид дейтерия для блокирования поля спектрометра ЯМР и 1 миллимоляр TMSP в качестве внутреннего эталона сигнала ЯМР. Также добавьте 10 микролитров 40-кратного стокового раствора полного коктейля ингибиторов протеазы.

Перенесите образец в 5-миллилитровую ЯМР-пробирку с помощью электронного шприца с длинной иглой или с помощью пипетки Пастера. Закройте ЯМР-трубку с помощью поршня. Удалите пузырьки воздуха, застрявшие между поршенем и жидкостью, перемещая поршень.

Поместите ЯМР-трубку в вращающуюся вертушку. С помощью соответствующего манометра отрегулируйте его вертикальное положение в спиннере таким образом, чтобы большая часть раствора образца находилась внутри катушки ЯМР. Далее запустите воздушный поток в ЯМР-приборе, нажав кнопку «Лифт» в окне системы управления магнитом. Осторожно поместите спиннер с трубкой в воздушный поток в верхней части отверстия магнита, затем остановите поток воздуха и дайте трубке опуститься на место внутри головки зонда внутри магнита.

После того, как образец уравновесится до 25 градусов Цельсия, введите «atmm» в командной строке, чтобы выполнить полуавтоматическую настройку и согласование головки зонда для оптимизации передачи мощности. Затем нажмите «Замок» в окне системы управления магнитом, чтобы включить блокировку частоты поля спектрометра.

Запустите процедуру шимминга для оптимизации однородности магнитного поля в месте расположения образца, сначала набрав «topshim gui» в командной строке, чтобы открыть окно прокладки. Затем нажмите «Пуск» в окне прокладки экрана. Проверьте нулевое отклонение остаточного B для проверки оптимального расположения прокладок.

Далее калибруем параметр P1, который представляет собой длину протонного радиочастотного импульса в микросекундах. Этот параметр необходим для получения вращения спина протона на 90 градусов. Стремитесь к 360-градусному импульсу, используя одномерный спектр водных протонов.

Отрегулируйте смещение частоты, установив параметр 01 на частоту протонной воды в одномерном спектре. Наконец, начните получение одномерного спектра протона, набрав «zg» в командной строке.