Прямой иммуноферментный анализ на основе рамановской спектроскопии для выявления специфического антигена

Начните с инкубации молекул рамановского репортерного красителя с наночастицами золота, чтобы репортеры могли связываться с наночастицами.

Добавить полиэтиленгликоль, ПЭГ-конъюгированные антитела, специфичные к целевому антигену. Антитела ковалентно прикрепляются к наночастицам посредством связывания дисульфида золота. Добавьте тиол-конъюгированные ПЭГ, чтобы блокировать оставшиеся участки наночастиц и предотвратить агрегацию наночастиц, образуя зонды наночастиц.

Покройте лунки иммуноферментного анализа лунками с целевым антигеном. Заблокируйте оставшиеся участки пластин раствором, содержащим белки. Добавьте зонды наночастиц. Выполните серийное разубоживание зонда по лункам. Инкубируйте антитела в зондах, чтобы они связывались с антигенами, образуя комплексы.

Используйте рамановский микроскоп для определения оптического отклика зонда. Падающий монохроматический лазер возбуждает поверхностные электроны наночастиц золота и вызывает их колебания, создавая на поверхности зонда сильное локальное электромагнитное поле.

Падающий луч и рамановские репортеры взаимодействуют, вызывая усиленное неупругое излучение или комбинационное рассеяние с различными длинами волн и частотами из-за усиленного электромагнитного поля. Неупруго излучаемый комбинационный сигнал используется для генерации рамановского спектра.

Нанесите график спектральной площади пика репортера комбинационного рассеяния света в зависимости от концентрации зонда, чтобы найти нижний предел обнаружения зонда и облегчить более чувствительное обнаружение антигена.

Для того чтобы подготовить зонды комбинационного рассеяния, сначала изготовьте две партии наночастиц золота по 1,5 миллилитра и репортер комбинационного рассеяния света в концентрациях, определенных как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Это достигается путем объединения репортера комбинационного рассеяния света и растворов наночастиц золота и их связывания в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем добавьте раствор PEGylated антитела к одному из растворов наночастиц золота, связанных с репортером, чтобы создать соотношение антител к частицам 200 к 1. Это решение будет для тестовых образцов.

В отдельной микроцентрифужной пробирке добавьте ПЭГилированный антиген к другому раствору наночастиц золота, связанному с репортером, в соотношении антиген к частицам 200 к 1, который будет использоваться в качестве контроля. Инкубируйте оба раствора в течение 30 минут при комнатной температуре.

Далее заблокируйте оставшиеся участки на поверхности наночастицы. Для этого сначала растворите твердый метоксиполиэтиленгликоль тиол до 200-микромольной концентрации с помощью воды ВЭЖХ. Вортексируйте раствор до полного растворения тиола. Затем добавьте раствор тиола в соотношении 40 000 к 1 к растворам ПЭГ-антител, связанным с наночастицами, и инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы убедиться, что оставшиеся участки на наночастице золота заблокированы.

Затем восстановите функционализированные зонды комбинационного рассеяния света, центрифугируя частицы в центрифужных пробирках с низкими границами, чтобы надосадочная жидкость была прозрачной. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, но будьте осторожны, чтобы не повредить наночастицы. Затем ресуспендируйте наночастицы с помощью 1 миллилитра PBS.

Оцените концентрацию наночастиц золота, проведя УФ-видимое измерение примерно с трех микролитров раствора, и сравните результаты с известными концентрациями наночастиц золота, поскольку это линейная зависимость.

Если наночастицы недостаточно заблокированы, они будут агрегироваться из-за сил адгезии между частицами, что позволяет предположить, что реагенты были добавлены в неправильных концентрациях. Обычно раствор имеет темно-красный цвет, но агрегация создает серый оттенок.

Отрегулируйте объем таким образом, чтобы конечные растворы составляли не менее 1 x^10-11 частиц на миллилитр, и храните растворы при температуре 4 градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут использованы для функционализации иммуноферментной пластины. Используйте эти решения в течение одной недели. Во-первых, приготовьте достаточное количество разбавленного антигена для заполнения полистирольных лунок. Затем перебейте раствор в вихрь и сразу же добавьте раствор в пластины лунок.

Дайте антигену закрепиться на пластинах в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем удалите избыток раствора антигена, вылив раствор и ударив тарелку о столешницу, покрытую бумажным полотенцем. Добавьте TBST в лунки для промывки поверхности. Затем удалите белье, снова вылив раствор и ударив тарелкой о столешницу, покрытую бумажным полотенцем.

Затем заблокируйте оставшиеся участки связывания на планшете, чтобы предотвратить неспецифическое связывание, добавив 70 микролитров раствора, блокирующего HSA, в каждую лунку планшета и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем удалите блокирующий раствор и трижды промойте пластину TBST, как было продемонстрировано ранее. После снятия последнего полоскания накройте тарелку крышкой и храните ее в сухом виде при температуре 4 градуса Цельсия до дальнейшего использования.

Добавьте 140 микролитров предварительно подготовленных наночастиц зонда в первую колонку 96-луночного планшета, поместив испытуемые наночастицы в первые пять рядов, а контрольные наночастицы в последние три ряда. Добавьте 70 микролитров PBS во все остальные колонки.

Разбавьте каждую колонку с помощью последовательного разведения от 1 до 2. Начните с того, что возьмите 70 микролитров из первой колонки, и смешайте их со второй. Затем возьмите 70 микролитров из второго столбца и добавьте его в третий, и так далее. Дайте пластине поинкубироваться не менее одного часа.

Затем извлеките несвязанные зонды наночастиц и промойте пластину TBST пять раз, как было показано ранее. После окончательной промывки добавьте в каждую лунку по 70 микролитров PBS и накройте пластину уплотнителем. Убедитесь, что контрольные образцы прозрачны. Если произошло неспецифическое связывание, контрольные образцы будут иметь цвет, аналогичный испытуемым.

С помощью инвертированного рамановского микроскопа сфокусируйте объектив на поверхности лунки, в которой находятся зонды наночастиц золота. Получение спектров комбинационного рассеяния света скважины. Соберите спектр в диапазоне от 1800 до 400 обратных сантиметров и повторите это для каждой лунки. Наконец, выполните действия, описанные в последнем разделе сопроводительного текстового протокола, чтобы определить конфиденциальность настройки.