Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

Общая цель данной процедуры — наглядно продемонстрировать этапы использования набора Lookout для ПЦР-детекции микоплазмы, оптимизированного для обнаружения контаминации микоплазмами. Это достигается путем предварительного нагрева образцов до 95 °C для инактивации любых молекул ДНК, которые могли бы сделать целевую матрицу непригодной для ПЦР. Затем образцы подготавливают к ПЦР, используя прилагаемые пробирки, в которые заранее добавлены нуклеотиды, праймеры и ДНК внутреннего контроля.

Третьим этапом процедуры является температурное циклирование в условиях, тщательно оптимизированных для обеспечения максимальной чувствительности и исключения неспецифической амплификации. В конечном итоге можно получить результаты, позволяющие определить, загрязнены ли исследуемые образцы микоплазмой, путем анализа с помощью агарозного гель-электрофореза. Основным преимуществом данного метода перед существующими является то, что реагенты предварительно дозированы и используются высококачественные ПЦР-пробирки.

Это делает процесс более удобным и эффективным. Еще одним преимуществом данного набора является то, что для обнаружения контаминации требуется менее двух геномов микоплазмы на микролитр образца. При выполнении процедуры по обнаружению микоплазмы важно избегать любого возможного загрязнения: для этого необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, чтобы свести к минимуму контакт с кожей, убедиться, что все используемые реагенты свободны от загрязнений, и постоянно соблюдать надлежащую технику асептики.

Процедуру можно проводить непосредственно с супернатантами клеточных культур или подготовить образцы для использования в дальнейшем. Чтобы подготовить образцы для последующего использования, поместите 100 µL каждого супернатанта в стерильную пробирку для амплификации и инкубируйте при 95 °C в течение пяти минут. После инкубации образцы можно хранить при температуре от 2 до 8 °C не более одной недели.

Непосредственно перед анализом образцов кратковременно центрифугируйте их для осаждения клеточного дебриса. Чтобы подготовить образцы к ПЦР, сначала определите общий объем буфера для регидратации ДНК-полимеразы, необходимый для проведения реакций. Одну единицу ДНК-полимеразы на реакцию следует добавить в соответствующий объем буфера для регидратации, который зависит от используемой Taq-полимеразы; в данной демонстрации будет использоваться jumpstart TAC D 93 0 7 в пяти реакциях: три образца, один положительный контроль и один отрицательный контроль.

Перенесите рассчитанный объем ДНК-полимеразы в чистую микроцентрифужную пробирку, затем добавьте рассчитанный объем буфера для регидратации. Осторожно перемешайте ДНК-полимеразу с буфером для регидратации, слегка постукивая по пробирке. Не используйте вортекс для перемешивания этой смеси.

Используйте прозрачные реакционные пробирки, входящие в комплект, для подготовки отрицательного контроля и образцов. Эти реакционные пробирки уже содержат нуклеотиды, праймеры и внутренний контрольный ДНК; внесите в них пипеткой 23 µL предварительно подготовленного буфера для регидратации ДНК-полимеразы. Перемешайте содержимое каждой пробирки с отрицательным контролем и образцами.

Затем добавьте 2 µL воды, свободной от ДНК, в пробирку с отрицательным контролем и по 2 µL каждого образца в соответствующие пробирки с образцами. Перемешайте содержимое, слегка постукивая по пробиркам. Перемешивание на вортексе не допускается.

Для подготовки положительного контроля используйте розовые реакционные пробирки, входящие в набор. В эти пробирки уже добавлены нуклеотиды, праймеры и ДНК внутреннего контроля в 25 мкл смеси буфера для регидратации ДНК-полимеразы. Перемешайте содержимое, слегка постукивая по пробирке; содержимое нельзя подвергать вортексированию.

Затем инкубируйте пробирки с положительным контролем, отрицательным контролем и образцами при комнатной температуре в течение пяти минут. По истечении пяти минут перенесите все пробирки с реакционной смесью в амплификатор. Для проведения ПЦР установите следующие условия на 40 циклов.

94 °C в течение 30 секунд. 55 °C в течение 30 секунд и 72 °C в течение 40 секунд. При использовании Jumpstart tack стадия активации не требуется.

После завершения циклов ПЦР извлеките образцы из амплификатора и поместите их на лед для охлаждения до температуры от 4 до 8 °C. Затем образцы можно нанести на agarose gel для электрофореза: внесите по 8 µL каждой ПЦР-реакции в отдельные лунки. Добавлять буфер для нанесения и краситель перед загрузкой образцов не требуется, так как они уже входят в состав реакционной смеси в пробирках.

Остановите электрофорез после того, как индикаторный краситель переместится на 2,5–3 см. Типичные результаты выявления микоплазмы методом ПЦР представлены на данном изображении дорожки agarose-геля. Дорожка 2 является отрицательным контролем, в которой должна наблюдаться полоса примерно 481 bp.

Отсутствие полосы отрицательного контроля размером 481 п.н. является хорошим индикатором того, что использованный TAC был недостаточно чувствительным. В образцах, положительных на микоплазму, будут видны полосы в диапазоне 270 ± 8 п.н., как показано в дорожках с трех по шесть. Полоса будет интенсивной для сильно контаминированных образцов и слабой для образцов с низкой степенью контаминации.

Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль для подтверждения того, что ПЦР прошла в соответствии с ожиданиями. Отсутствие внутреннего контроля в сильно загрязненных образцах является нормальным явлением. Отсутствие полосы как в положительном, так и в отрицательном диапазонах, как показано в дорожке семь, служит надежным индикатором ингибирования образцов.

Если образец ингибирован, ингибиторы ПЦР можно удалить, проведя экстракцию ДНК. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять все необходимые этапы, описанные в инструкции к набору, а также как интерпретировать результаты и решать возникающие проблемы.