Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

Общая цель данной процедуры — наглядно продемонстрировать этапы использования набора для ПЦР-детекции микоплазм Lookout, оптимизированного для выявления контаминации микоплазмой. Для этого сначала образцы нагревают до 95 °C, чтобы инактивировать молекулы ДНК, которые могли бы сделать целевую матрицу непригодной для ПЦР. Затем образцы подготавливают к ПЦР, используя прилагаемые пробирки, в которые предварительно добавлены нуклеотиды, праймеры и ДНК внутреннего контроля.

Третьим этапом процедуры является температурное циклирование в условиях, тщательно оптимизированных для обеспечения максимальной чувствительности и исключения неспецифической амплификации. В конечном итоге, путем проведения электрофореза в агарозном геле, можно получить результаты, позволяющие определить, контаминированы ли исследуемые образцы микоплазмой. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими является то, что реагенты предварительно подготовлены, а используются высококачественные ПЦР-пробирки.

Это делает процесс более удобным и эффективным. Еще одним преимуществом данного набора является то, что для обнаружения контаминации требуется менее двух геномов микоплазмы на микролитр образца. При выполнении процедуры по обнаружению микоплазмы важно избегать любого возможного загрязнения: для этого следует использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, чтобы свести к минимуму контакт с кожей, убедиться, что все используемые реагенты не контаминированы, и постоянно соблюдать надлежащую технику асептики.

Процедуру можно проводить непосредственно с супернатантами клеточных культур либо подготовить образцы для последующего использования. Чтобы подготовить образцы для последующего использования, перенесите 100 µL каждого супернатанта в стерильную пробирку для амплификации и инкубируйте при 95 °C в течение пяти минут. После инкубации образцы можно хранить при температуре от 2 до 8 °C до одной недели.

Непосредственно перед тестированием образцов кратковременно центрифугируйте их для осаждения клеточного дебриса. Для подготовки образцов к ПЦР сначала определите общий объем буфера для регенерации ДНК-полимеразы, необходимый для проведения реакций. На соответствующий объем буфера для регенерации следует добавить по одной единице ДНК-полимеразы на каждую реакцию; этот объем зависит от используемой Taq-полимеразы. В данной демонстрации будет использоваться jumpstart TAC D 93 0 7 для пяти реакций: трех образцов, одного положительного и одного отрицательного контроля.

Перенесите рассчитанный объем ДНК-полимеразы в чистую микроцентрифужную пробирку, затем добавьте рассчитанный объем буфера для регидратации. Осторожно перемешайте ДНК-полимеразу с буфером для регидратации, слегка постукивая по пробирке. Не используйте вортекс для перемешивания этой смеси.

Используйте прозрачные реакционные пробирки, входящие в комплект, для подготовки отрицательного контроля и образцов. В этих пробирках уже содержатся нуклеотиды, праймеры и ДНК внутреннего контроля; долейте в каждую пробирку 23 µL предварительно подготовленного буфера для регидратации ДНК-полимеразы. Перемешайте содержимое каждой пробирки с отрицательным контролем и образцами.

Затем добавьте 2 µL воды, не содержащей ДНК, в пробирку с отрицательным контролем и по 2 µL каждого образца в соответствующие пробирки с образцами. Перемешайте содержимое, слегка постукивая по пробиркам. Вортексирование содержимого не допускается.

Для приготовления положительного контроля используйте розовые реакционные пробирки, входящие в комплект. Эти пробирки уже содержат нуклеотиды, праймеры и ДНК внутреннего контроля; в каждую пробирку следует добавить 25 µL смеси буфера для регидратации ДНК-полимеразы. Перемешайте содержимое, слегка постукивая по пробирке; перемешивание с помощью вортекса недопустимо.

Затем инкубируйте пробирки с положительным контролем, отрицательным контролем и образцом при комнатной температуре в течение пяти минут. По истечении пяти минут перенесите все реакционные пробирки в амплификатор. Для проведения ПЦР установите следующие условия на 40 циклов.

94 °C в течение 30 секунд. 55 °C в течение 30 секунд и 72 °C в течение 40 секунд. При использовании Jumpstart tack стадия активации не требуется.

После завершения циклов ПЦР извлеките образцы из амплификатора и поместите их на лед для охлаждения до температуры от 4 до 8 °C. Затем образцы можно нанести на agarose gel для электрофореза: внесите по 8 µL каждой ПЦР-реакции в отдельные лунки. Добавление буфера для нанесения и красителя перед загрузкой образцов не требуется, так как они уже содержатся в пробирках с реакционной смесью.

Остановите электрофорез после того, как краситель-маркер мигрирует на 2,5–3 см. Репрезентативные результаты выявления микоплазмы методом ПЦР представлены на данном изображении дорожки agarose gel. Дорожка 2 является отрицательным контролем, в которой должна наблюдаться полоса размером приблизительно 481 bp.

Отсутствие полосы отрицательного контроля размером 481 п.н. является хорошим показателем того, что использованный TAC был недостаточно чувствительным. В образцах с положительным результатом на Mycoplasma будут видны полосы в диапазоне 270 ± 8 п.н., как показано в дорожках с третьей по шестую. Полоса будет интенсивной для сильно контаминированных образцов и слабой для образцов с низкой степенью контаминации.

Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль для подтверждения того, что ПЦР прошла ожидаемым образом. Отсутствие внутреннего контроля в сильно контаминированных образцах является нормальным явлением. Отсутствие полос как в положительном, так и в отрицательном диапазонах, как показано в дорожке семь, служит надежным индикатором ингибирования образцов.

Если образец ингибирован, ингибиторы ПЦР можно удалить путем экстракции ДНК. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выполнять все необходимые шаги, описанные в инструкции к набору, а также как интерпретировать результаты и проводить поиск и устранение неисправностей при необходимости.