Выделение макрофагов из ганглия дорсального корешка мыши с помощью механической диссоциации

Ганглий дорсального корешка, или DRG, представляет собой скопление тел нейронных клеток вдоль спинного мозга, которые передают сенсорную информацию от периферической к центральной нервной системе. Повреждение периферических нервов вызывает накопление макрофагов в ДРГ и развитие нейропатической боли.

Чтобы изолировать жизнеспособные макрофаги методом без ферментов, возьмите свежепрепарированную ткань DRG мыши в гомогенизаторе, заполненном ледяным буфером, чтобы ограничить клеточный стресс. С помощью пестика механически гомогенизируйте ткань, чтобы освободить клетки.

Профильтруйте через клеточный фильтр, чтобы удалить клеточные комки и получить одноклеточную суспензию в проточном канале. Тканевый гомогенат содержит нейроны и ненейрональные клетки, к которым относятся макрофаги и свободно плавающий миелин — изолирующая оболочка нейронов.

Добавьте отфильтрованный гомогенат в пробирку, содержащую среду с градиентом плотности, и центрифугуйте. Под действием центробежной силы жизнеспособные клетки с более высокой плотностью плавучести оседают на дне трубки, образуя гранулу, в то время как миелин остается во взвешенном состоянии. Выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендировать клетки в буфере, содержащем флуорофор-конъюгированные антитела против макрофагально-специфических рецепторов клеточной поверхности. Инкубируйте в течение необходимого времени. Антитело связывается со своим рецептором на клетках макрофагов, таким образом, флуоресцентно мечет поверхность клетки. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра. Специфический для антител флуоресцентный сигнал указывает на наличие макрофагов в образце.

Перед началом эксперимента приготовьте рабочий раствор среды с градиентом плотности, смешав девять объемов среды с одним объемом 10X HBSS без кальция и магния, и держите его на льду. Подтвердите, что мышь полностью обезболена отсутствием реакции на щипок задней лапы.

Начните с помещения мыши, находящейся под наркозом, в вытяжной шкаф для химических веществ в положении лежа на спине, с четырьмя лапами, закрепленными скотчем. С помощью щипцов подтяните кожу ниже грудной клетки, а затем хирургическими ножницами сделайте небольшой разрез, чтобы обнажить печень и диафрагму. С помощью тех же ножниц разрежьте диафрагму и грудную клетку, а затем откройте плевральную полость, чтобы обнажить бьющееся сердце.

Далее ножницами по радужной оболочке быстро перережьте правый придаток предсердия. Как только кровотечение будет отмечено, введите иглу 30-го калибра в задний конец левого желудочка и медленно введите 10 миллилитров предварительно охлажденного 1X PBS для перфузии животного.

Чтобы выполнить дорсальную ламинэктомию, поместите мышь в положение лежа. Используйте скальпель размера 11, чтобы сделать два продольных боковых глубоких разреза, начиная от грудного отдела вниз до крестцового отдела. Затем снимите кожу, обнажив дорсальный мышечный слой. Затем с помощью Фридмана-Пирсона Ронгера отшелушивайте соединительные ткани и мышцы до тех пор, пока не обнажатся пояснично-крестцовые отростки позвоночника и двусторонние поперечные отростки.

Во-первых, используйте Ронгера Фридмана-Пирсона, чтобы осторожно открыть дорсальный позвоночник. Затем переключайтесь между пружинными ножницами Фридмана-Пирсона и Нойесом, чтобы удалить позвоночные кости, обнажив спинной мозг с прикрепленными неповрежденными спинномозговыми нервами. Тщательно рассекайте ипсилатеральную и контралатеральную поясничную ДРГ.

Поместите его в 1 миллилитр ледяного кальция и магния 1X HBSS без магния в гомогенизаторе тканей Dounce. Гомогенизируйте ткань DRG в гомогенизаторе Dounce рассыпным пестиком от 20 до 25 раз. Поместите стерильный нейлоновый клеточный фильтр толщиной 70 микрометров в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Используйте 800 микролитров ледяного 1X HBSS для смачивания сетевого фильтра.

С помощью пипетки соберите гомогенизированную тканевую суспензию из гомогенизатора на фильтр для влажных клеток и соберите ее в 50-миллилитровую коническую трубку. Дважды промойте гомогенизатор 800 микролитрами ледяного 1X HBSS, собирая жидкость в ту же 50-миллилитровую коническую трубку для увеличения выхода.

Добавьте 1,5 миллилитра уравновешенной ледяной изотонической среды градиента плотности в стерильную 5-миллилитровую полистирольную пробирку FACS. Перенесите гомогенат клеток из конической пробирки объемом 50 миллилитров в эту трубку FACS и пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.

Добавьте еще 500 микролитров 1X HBSS, чтобы запечатать верх. Центрифугируйте клетки при 800 умноженных на g в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, содержащую миелин в среде, не нарушая клеточную гранулу на дне пробирки.

Добавьте в гранулу 100 микролитров PBS, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, и ресуспендируйте клетки DRG. Затем добавьте в клетки антитела альфа-мыши CX3CR1-APC и инкубируйте в темноте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 1 часа.

Промойте клетки один раз 5 миллилитрами PBS. Центрифугируйте клетки при 360 умноженных на g в течение 8 минут при 4 градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость, а затем ресуспендируйте клеточную гранулу в 300 микролитрах PBS для анализа FACS.