Биохимические Восстановление стероидных рецепторов • Hsp90 белковые комплексы и Реактивация связывания лигандов

Общая цель данной процедуры заключается в биохимической реконституции белкового комплекса стероидного рецептора и Hsp90, а также в восстановлении способности стероидного рецептора связывать лиганд, что может быть использовано для изучения требований к кофакторам Hsp90 и эффектов добавления экзогенных соединений в процесс реконституции. Это достигается путем первоначального приготовления цитозоля клеток, содержащего функциональные глюкокортикоидные рецепторы. Затем GR из цитозоля клеток подвергается иммуноабсорбции и удалению эндогенных факторов.

HSP 90 диссоциирует. Затем гетерокомплекс GR HSP 90 реконструируется с использованием экзогенного источника HSP 90, других шаперонных белков и кофакторов. Наконец, анализируют реконструированные белковые комплексы и активность связывания лигандов; в частности, для подтверждения формирования гетерокомплекса GR HSP 90 и активности связывания стероидов используются такие методы, как электрофорез в ПААГ с SDS, вестерн-блоттинг и радиолигандный анализ.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярных шаперонов HSP 90, такие как определение того, какие кофакторные и COS-шапероны необходимы для обеспечения функциональной активности HSP 90. Хотя данный метод позволяет получить представление о фолдинге белков, он также может быть применен к другим системам, например, для разработки зависимых от HSP 90 ведущих соединений и анализа внутриклеточных сигнальных путей, требующих участия HSP 90. Демонстрацию процедуры проведут Ханна Франклин и Нейтан Фор Ава, два недавно окончивших обучение студента моей лаборатории. Для выделения функционального глюкокортикоидного рецептора или GR вырастите клетки фибробластов мыши L 9 29 или клетки SF nine, зараженные рекомбинантным бакуловирусом GR и находящиеся в фазе экспоненциального роста. Центрифугируйте клеточную суспендию при 5 000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C.

Полученный осадок должен иметь объем примерно от одного до пяти миллилитров. Промойте осадок клеток три раза 15 миллилитрами сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Приготовьте 1,5 объема буфера для гомогенизации, содержащего буфер HEM, 1 mM фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и три таблетки полного мини-ингибитора протеаз, растертые в ступке с помощью 50 движений пестика.

Клетки разрушали с помощью гомогенизатора; процедуру проводили на льду для предотвращения деградации белков. Гомогенат центрифугировали в ультрацентрифуге при 100 000 G в течение 30 минут при температуре 4 °C. Супернатант, содержащий цитозоль, разделяли на аликвоты по 500 µL в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и хранили при температуре -20 °C.

Для приготовления смеси, содержащей моноклональное IgG-антитело к специфическому рецептору GR, объедините 100 µL размороженного цитозоля, содержащего GR, 200 µL буфера TEGM, 100 µL 20%-ной суспензии протеиновых сфер asero или PAS и 5 µg моноклонального IgG-антитела anti-G, такого как bugger two. Из-за относительно большого размера сфер PAS.

Используйте обрезанный наконечник дозатора P 200 для переноса PAS из 20%-й суспензии в пробирки с образцами. Поместите образцы на вертикальный ротатор и инкубируйте не менее двух часов при постоянном вращении. Затем удалите несвязанные белки из осадка антител PAS, центрифугируя образцы в охлаждаемой центрифуге в течение одной минуты.

При 10 000 G дважды промойте осадок, добавляя один миллилитр буфера TEGM с последующим перемешиванием на вортексе и центрифугированием. Удалите финальный промывочный раствор, используя загнутый наконечник дозатора P 200, чтобы диссоциировать эндогенный HSB 90 из иммуноосадка GR, затем добавьте к антителам 355 мкл буфера TEG и 45 мкл 5 M раствора хлорида натрия. Осадок PAS был подготовлен ранее.

Поместите образцы на вертикальный ротор и инкубируйте в течение полутора часов при постоянном вращении. Удалите несвязанные белки из иммуноосадка, центрифугируя их в течение одной минуты при 10,000 Gs. Промойте осадки один раз одним миллилитром буфера TEG и один раз одним миллилитром 10 мМ HEPES-буфера (pH 7.4). С помощью наконечника дозатора P 200 с фильтром удалите промывочный раствор, стараясь не задеть осадок.

Для реконституции гетерокомплекса GR HSB 90 к осадку добавьте смесь, содержащую 50 µL источника молекулярных шаперонов, например, лизата ретикулоцитов кролика, и 5 µL системы синтеза ATP. Следующий этап является критически важным для обеспечения надлежащего перемешивания осадка и раствора для реконституции. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 30 °C ровно 20 минут.

Каждые одну-две минуты встряхивайте пробирки, чтобы осторожно разбить осадок и перемешать раствор для реконституции. Добавьте 1 мл буфера TEGM, перемешайте на вортексе и центрифугируйте при 10 000 G в течение одной минуты. Удалите супернатант, стараясь не задеть осадок.

Повторите промывку еще дважды, чтобы идентифицировать белки в реконструированном осадке. Подготовьте образцы для электрофореза, добавив 50 µL буфера для SDS-PAGE, содержащего бета-меркаптоэтанол. Перемешайте образцы, затем инкубируйте в течение пяти минут в кипящей водяной бане или в электронном нагревательном блоке при 100 °C.

Центрифугируйте образцы при 10 000 G в течение одной минуты. Используйте супернатант из этих образцов для SDS-PAGE или микрофлюидного электрофореза с последующим вестерн-блоттингом. Использование наконечника P 200 с ограничителем при нанесении супернатанта позволит избежать случайного аспирирования осадка.

Следующим шагом является анализ комплекса белков GR HSP 90 на активность связывания стероидов. Используя тритированный стероид, начните с добавления к реконструированному иммунопреципитату 47,5 µL буфера HEM и 2,5 µL 2 µM тритированного дексаметазона.

Осторожно перемешайте осадок, стараясь свести к минимуму количество образца, прилипшего к стенке микроцентрифужной пробирки. Инкубируйте образец на льду в течение ночи без перемешивания. Добавьте 1 mL буфера TEGM, осторожно перемешайте и центрифугируйте при 10 000 ×g в течение одной минуты.

Осторожно слейте супернатант. Он содержит несвязанный тритиевый стероид; повторите процедуру промывки буфером TEGM в общей сложности три раза. После завершения последнего этапа промывки полностью удалите весь супернатант.

Используя наконечник для дозирования P 200 с зажимом, суспендируйте промытые иммуноосадки в 200 µL буфера TEGM и перенесите их в сцинтилляционные флаконы объемом 10 мл.

Добавьте 4,8 миллилитров сцинтилляционного коктейля в пробирки и перемешайте на вортексе. Наконец, проведите жидкостную сцинтилляционную спектрометрию; здесь представлены репрезентативные данные электрофореза в ПААГ в седиментирующих условиях (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга на геле с окрашиванием кумази. Эндогенный гетерокомплекс GR Hsp90 иммунопреципитируют из цитозоля клеток с использованием антител к GR, после чего визуализируют отдельные белки, ко-преципитировавшие с GR.

Ниже представлены данные микрофлюидной электрофорезы Experian, отражающие реконструированные гетерокомплексы GR и HSP 90. Специфичность иммуноабсорбции GR подтверждается тем, что при замене антител к GR неиммунным антителом иммунопреципитация GR или молекулярных шаперонов не происходит даже при использовании избыточного количества антител.

Аналогичным образом, диссоциацию HSP 90 и других белков-шаперонов от GR, подвергнутого вымыванию солью, можно подтвердить с помощью вестерн-блоттинга осажденных иммунопреципитатов после вымывания и реконституции. Тяжелая цепь иммуноабсорбирующего антитела обнаруживается как при окрашивании кумази, так и методом вестерн-блоттинга, что подтверждает визуализацию иммунопреципитатов равного объема в каждой дорожке. Здесь представлены репрезентативные данные о стероидной связывающей активности иммуноабсорбированного GR с использованием либо ретикулоцитарного лизата, либо очищенных белков.

Связывающая активность стероидов реконструированного гетерокомплекса GR Hsp90 обычно восстанавливается до 75–100% от уровня связывающей активности эндогенного GR Hsp90. По аналогии с данными электрофореза, в качестве отрицательного контроля и для оценки неспецифического связывания тритиевых стероидов вместо антител к GR можно использовать неиммунные антитела. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как двумерный электрофорез в ПААГ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о влиянии посттрансляционных модификаций Hsp90 на реконструкцию гетерокомплекса и связывание стероидов. Анализы реконструкции, подобные описанным здесь, позволили исследователям изучить функциональное значение шаперонной системы MultiPro на основе Hsp90 и Hsp70 и ее поэтапную сборку, используя глюкокортикоидный рецептор в качестве модельного белка-клиента Hsp90.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать функциональные белковые комплексы глюкокортикоидного рецептора с HSP 90 из очищенных белков в клеточных лизатах. Используемые этапы включают подготовку лизата клеток, содержащего GR, иммуноабсорбцию рецептора, вымывание эндогенных белков солью и реконституцию гетерокомплекса с использованием экзогенных HSP 90, кофакторов HSP 70 и кошаперонов.