Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков

Общая цель данной процедуры — подобрать оптимальную колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя автоматизированный метод предварительного скрининга для очистки рекомбинантного белка с помощью системы жидкостной хроматографии среднего давления BioRad DUO flow. Для этого сначала подготавливаются необходимые буферы и бактериальные лизаты, содержащие целевой рекомбинантный белок. Затем выполняется физическая установка системы хроматографии DUO flow, подключаются линии подачи жидкости и проводится подготовка к протоколу скрининга.

Затем образцы загружаются, и запускается запрограммированный метод подбора колонки для гидрофобинной хроматографии (HI) для сбора фракций элюата. В завершение анализируется элюат, и на основании наблюдаемых характеристик разделения определяются оптимальная колонка HI и сорбент. В итоге можно получить результаты, указывающие на предпочтительный сорбент колонки HI для масштабируемой очистки интересующего исследователя белка методом среднедавлениемной жидкостной хроматографии с использованием автоматизированных возможностей системы DUO flow по подбору колонок HI.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как последовальное проведение ручной колоночной хроматографии, является то, что автоматизация процесса снижает вариабельность и обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Как правило, специалисты, ранее не применявшие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за технической сложности современных систем жидкостной хроматографии, однако этому можно легко обучиться.

После достаточной подготовки процедуру продемонстрируют Оранж Стоун и Шелли Андерсон, две студентки моей лаборатории. Для начала приготовьте по 500 миллилитров следующих буферов: 200 миллимолярный натрий-фосфатный буфер A1, 200 миллимолярный натрий-гидрофосфатный буфер A2 и 4,8 молярный раствор сульфата аммония для буфера B2; в качестве буфера B1 будет использоваться деионизированная вода. Дегазируйте буферы для обеспечения оптимальных условий хроматографического разделения. Система Maximizer будет смешивать буферы A1 и A2 для получения фосфатного элюирующего буфера с низкой концентрацией соли, а также буферы B1 и B2 для получения раствора сульфата аммония с высокой концентрацией соли.

Стартовый буфер. Подготовьте 20 миллилитров образца для нанесения, смешав 10 миллилитров клеточного лизата, содержащего очищаемый белок, с 10 миллилитрами буфера B2. Конечная концентрация сульфата аммония в растворе образца клеточного лизата должна составлять примерно 2.4 M, что делает его приблизительно эквивалентным стартовому буферу.

Профильтруйте смесь буфера для лизиса через шприцевой фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0.45 micrometer, чтобы удалить из раствора твердые частицы. Держите образец на льду до момента его загрузки в систему. Физическая настройка и сборка гидравлической системы хроматографа являются одним из самых сложных этапов данной процедуры.

Настройте систему двухпотоковой хроматографии в соответствии с представленной здесь схемой. Убедитесь, что имеется достаточный объем буфера для всего протокола и что трубки будут оставаться погруженными в жидкость. Подключите клапан подачи образца и динамическую петлю для образца, как показано здесь; соедините петлю для образца с входом клапана образца в позиции три.

Подготовьте восемь одинаковых по размеру пар трубок с внешним диаметром 1/16 дюйма. Затем подсоедините эти пары к позициям с первой по восьмую двух клапанов выбора колонок. После включения ламп УФ-детектора и подтверждения калибровки всех детекторов установите разделительный клапан потока и контроллер разделителя фракционного коллектора, как показано здесь.

Разделительный клапан и контроллер разделителя коллектора фракций в позиции два работают автономно от хроматографической станции. Установите процент разделения на 10. Замените стандартную головку дозатора коллектора фракций в позиции два на головку дозатора для микропланшетов.

Промойте петлю для образца и продуйте хроматографическую систему. Затем запустите ручной поток элюирующего буфера через систему со скоростью 1 мл/мин. Подключите колонки-ловушки HI объемом 1 мл к позициям со второй по восьмую клапанов выбора колонок.

Снимите соединительную муфту, соединяющую селекторные клапаны колонок второй позиции. Подсоедините фитинги передней колонки к системе DuoFlow. Пропустите элюирующий буфер через фитинги до полного удаления воздуха и появления крупной капли буфера.

Затем снимите пробку с входного отверстия колонки и нанесите большую каплю низкосолевого буфера на верхнюю часть колонки. После этого подсоедините колонку к верхним фитингам. Подключите выход колонки к нижним фитингам и трубкам селекционного клапана.

Установите лимит обратного давления на 40 PS.I. Промойте колонку пятью колоночными объемами элюирующего буфера при скорости потока 1 мл/мин. Промойте колонку десятью колоночными объемами стартового буфера при скорости потока 1 мл/мин.

После стабилизации показателей pH, УФ-детектирования и противодавления вручную переключите клапаны выбора колонки в положение один и остановите поток буфера. Для загрузки образца погрузите трубку ввода образца в образец объемом 20 milliliter. Затем переведите клапан промывки петли загрузки образца в положение один, а клапан загрузки образца — в режим продувки.

Запустите насос загрузки пробочной петли, чтобы прокачать образец в трубку насоса со скоростью 1 мл/мин до момента, когда образец достигнет клапана загрузки пробы. Переключите клапан загрузки пробы из режима продувки (purge) в режим загрузки (load). Снова запустите насос загрузки пробочной петли со скоростью 1 мл/мин через окно настроек программного обеспечения Biologic, пока в динамическую пробочную петлю не будет заполнено 10 мл образца.

Выберите устройства системы, отмеченные звездочкой в этой таблице. Затем выберите шесть колонок для ГИХ (HIC), которые будут включены в программу анализа. Линейный нисходящий градиент соли и метод предварительного анализа шести колонок запускают подачу стартового буфера вручную со скоростью 1 мл/мин.

Нажмите кнопку «Старт» на контроллере разделителя, чтобы начать разделение потока ЭИТ от 90% до 10%. Сразу после запуска метода программы нажмите кнопку «Старт» на экранной панели управления автономного коллектора фракций для 96-луночного планшета. Следите за дисплеем в реальном времени, чтобы подтвердить ожидаемые параметры запуска. Сравните кривую поглощения при 397 нм, специфичную для GFP, с кривой общего белкового поглощения при 280 нм, чтобы оценить относительное разделение и очистку при использовании различных исследуемых сред HI. Аликоты от 5 до 50 µL из фракций 96-луночного планшета можно перенести в новый планшет и проанализировать на содержание специфического белка с помощью ELISA или вестерн-блоттинга, а также на общее содержание белка с помощью SDS-PAGE или микрофлюидной системы электрофореза Experion. Здесь представлены типичные значения проводимости градиента соли HI и давления в колонке при предварительных запусках.

Изменение концентрации соли, определяемое по проценту буфера, подаваемого из линий с высокой концентрацией соли, типично для методологии HI. По мере снижения концентрации соли белки, связанные с колонкой, элюируются; проводимость, которая соответствует наблюдаемой концентрации соли, измеряется в линии непосредственно после квадрупольного детектора и УФ-детектора. Смещение между графиками градиента соли и проводимости указывает на время, необходимое для перемещения буфера от входа в систему через всю установку к монитору проводимости.

На протяжении всего запуска образца давление в системе и pH остаются относительно постоянными. На данном рисунке представлены хроматограммы последовательных предварительных запусков на колонке HI с использованием встроенного детектирования общего белка. Определение NGFP осуществляется путем измерения абсорбции света при 280 нм и 397 нм соответственно.

Возможно приблизительно определить относительное содержание и разделение GFP для каждого разведочного запуска. При сравнении двух линий на данном рисунке пробирки с культурами для фракций 10, 12, 14, 16 и 18 разведочного запуска фенхеля FF были визуализированы при обычном или флуоресцентном комнатном освещении и под ультрафиолетовыми лампами (как спереди, так и сверху) для наблюдения характерного спектра эмиссии GFP; GFP отчетливо обнаруживается во фракции 14. На обоих УФ-изображениях диффузный синий цвет на левой УФ-панели представляет собой свет, излучаемый УФ-лампой.

Эти данные, полученные после запуска, хорошо согласуются с результатами поточного детектирования GFP путем измерения абсорбции элюата при 397 нм, что также позволяет определить фракцию 14 как содержащую основной пик элюированного GFP. После выполнения данной процедуры для ответа на дополнительные вопросы, касающиеся чистоты и функциональной активности очищаемого белка, могут быть проведены другие методы анализа, такие как вестерн-блоттинг, ELISA, атомно-силовая микроскопия и анализы биохимической реконституции.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости ручного управления системой с двойным потоком на нескольких этапах метода. Примерами могут служить дозаправка буфера и загрузка образца, проверка на наличие пузырьков воздуха, а также включение и выключение детекторных ламп по мере необходимости. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать систему жидкостной хроматографии для автоматизированного подбора оптимальных колонок и сорбентов HI.

Анализ данных в режиме реального времени и по завершении процесса позволит исследователю выбрать подходящую колонку для последующего масштабирования очистки, которую также можно сочетать с другими хроматографическими методами для повышения чистоты и выхода целевого белка.