Магнитная изоляция микроглии из мозга детенышей мышей

Микроглия — резидентные макрофаги мозга — экспрессируют CD11b, интегрин клеточной поверхности.

Чтобы выделить микроглию из мозга детенышей мыши, берут фрагменты головного мозга в диссоциационные пробирки, содержащие буфер с папаином, протеолитическим ферментом и дезоксирибонуклеазой.

Поместите трубки на механический диссоциатор. Во время прогона диссоциатор механически разрушает ткани.

Папаин переваривает внеклеточный матрикс ткани, высвобождая клетки, в том числе микроглию, в суспензию. Дезоксирибонуклеаза разрушает свободную ДНК в суспензии, предотвращая неэффективную изоляцию клеток.

центрифуга. Завершите механическую диссоциацию пипетированием. Пропустите суспензию через клеточный фильтр, чтобы удалить мусор и клеточные комки и получить однородную популяцию одиночных клеток.

Инкубировать с суперпарамагнитными микрогранулами, функционализированными антителами к CD11b. Микрогранулы специфически связываются с CD11b на клетках, включая микроглию.

Постинкубация, центрифуга. Удалите надосадочную жидкость, содержащую несвязанные шарики. Снова суспендируйте ячейки в буфере. Груз на колонну, размещенную на магнитном сепараторе. Колонна состоит из матрицы с ферромагнитными шариками.

При размещении на сепараторе сферы внутри колонки усиливают магнитное поле, удерживая связанные с микрогранулами CD11b+ клетки внутри колонки, в то время как другие клетки протекают через нее.

Извлеките из сепаратора и используйте буфер для элюирования клеток CD11b+ из колонки. Центрифугируйте суспензию и ресуспендируйте клетки CD11b+ в среде микроглии.

Выделенные клетки готовы к дальнейшему анализу.

Приготовьте диссоциационную смесь в соответствии с этой таблицей. Перенесите 12 частей мозга в С-образную трубку общим весом 1,2 грамма на каждую диссоциационную трубку. Затем поместите С-образные трубки на диссоциатор с нагревом. Запустите оптимизированную программу NTDK в диссоциаторе. Центрифуга в течение 20 секунд. Завершите механическую диссоциацию трижды пипетированием.

Переложите клетки в четыре 15-миллилитровые пробирки с прикрепленными сетчатыми фильтрами. Промойте ситечки 10 миллилитрами HBSS с кальцием и магнием. Центрифугируйте в течение 10 минут, и удалите надосадочную жидкость 10-миллилитровой пипеткой. Осторожно добавьте 10 миллилитров HBSS с кальцием и магнием, и повторно суспензируйте гранулу. Снова центрифугируем и удаляем надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу с 6 миллилитров сортировочного буфера. Повторите центрифугирование и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 200 микролитров раствора CD11b-микрогранул и инкубируйте пробирки в течение 15-20 минут при температуре 4 градуса Цельсия. После инкубации повторно суспендируйте гранулу с 6 миллилитрами сортировочного буфера. Повторите центрифугирование и снова суспендируйте гранулу с 8 миллилитрами сортировочного буфера.

Далее следуя программе POSSEL на сепараторе подготовить восемь столбцов. Пропустите клетки через колонку, добавляя по 1 миллилитру клеточной суспензии за один раз. С помощью 1 миллилитра сортировочного буфера элюируйте CD11b-положительные клетки на стерильной элюирующей пластине. Соберите ячейки в 50-миллилитровую пробирку.

Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу с 10 миллилитрами холодной среды микроглии. Подсчитайте количество CD11b-положительных клеток. Ресуспендируйте клетки в холодной среде микроглии, чтобы получить конечную концентрацию от 650 000 до 700 000 клеток на миллилитр.