Оценка химически индуцированного колита с помощью иммуногистохимического анализа срезов ткани толстой кишки

У мышей слой слизистой оболочки толстой кишки состоит из иммунных клеток, содержащих собственную пластинку, окруженную плотно упакованным эпителием, защищающим слизистую оболочку. Химическая обработка сульфатом натрия декстрана разрушает плотные соединения, вызывая повреждение эпителиальных клеток и позволяя микробам просвета проникать в собственную пластинку.

Микробное распознавание в толстой кишке запускает секрецию хемокинов, что приводит к инфильтрации иммунных клеток и высвобождению провоспалительных цитокинов. Этот преувеличенный иммунный ответ приводит к воспалению толстой кишки или колиту.

Чтобы оценить химический колит, начните со предметного стекла с фиксированным, предварительно обработанным участком ткани толстой кишки мыши, демонстрирующим химически индуцированный колит. Обработайте секцию коктейлем первичных антител, специфичных к рецепторам иммунных клеток, которые связываются с соответствующими иммунными клетками.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела. Инкубируйте участок ткани с биотинилированными вторичными антителами, которые специфически связываются с первичными антителами. Инкубируются со стрептавидин-ферментными конъюгатами, которые взаимодействуют с биотинами, образуя комплексы.

Наложите на участок ткани хромогенный субстрат, и взаимодействие фермент-субстрат придаст иммунным клеткам коричневую окраску. Контрокрашивание участка гематоксилиновым красителем для окрашивания ядров клеток.

Понаблюдайте за испачканным предметным стеклом под микроскопом. Обилие коричневых иммунных клеток в поврежденной области указывает на химически индуцированный колит.

Для иммуногистохимического анализа после нагрева срезов в течение 20 минут на горячей плите трижды промыть предметные стекла в PBS в течение 10 минут за одну промывку и устранить эндогенную пероксидазу с помощью 10-минутной инкубации 3% перекисью водорода.

В конце инкубации промывайте образцы три раза в PBS, как показано на рисунке, и блокируйте любое неспецифическое связывание блокирующим буфером в течение не менее одного часа при комнатной температуре. Затем замените блокирующий буфер основным интересующим коктейлем антител для ночной инкубации при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующее утро аспирируйте избыток первичного раствора антител и трижды промойте предметные стекла в PBS. После последней промывки предметные стекла инкубируют с соответствующим биотинилированным коктейлем вторичных антител с последующим мечением стрептавидиновым комплексом пероксидазы хрена при комнатной температуре.

Чтобы визуализировать иммунореактивные клетки, пометьте образцы DAB до тех пор, пока не появится светло- или темно-коричневый цвет, и закрасьте срезы гематоксилином и 0,3% разбавленным аммиаком.

Когда предметные стекла высохнут, используйте световой микроскоп для получения светлопольных изображений участков ткани при 10-кратном увеличении, а также используйте программу обработки изображений для идентификации и количественной оценки популяции помеченных иммунных клеток как в эпителии, так и в собственной пластинке.