Выявление активации инфламмасом с помощью флуоресцентной микроскопии

Чтобы обнаружить активацию инфламмасом NOD-подобного рецептора P3, или NLRP3, берут многолуночный планшет, содержащий активированные макрофаги, экспрессирующие белки NLRP3.

Обрабатывайте клетки средами, содержащими ионофоры и глицин. Ионофоры индуцируют отток ионов калия, активируя и олигомеризуя белки NLRP3. Олигомеризированный NLRP3 рекрутирует адапторные белки, облегчая связывание про-каспазы-1, образуя инфламмасомный комплекс NLRP3.

На инфламмасоме близость запускает ауторасщепление про-каспазы-1, высвобождая активные каспазы, инициируя пироптоз и ядерную конденсацию. Кроме того, глицин стабилизирует клеточную структуру, предотвращая лизис клеток.

Обрабатывайте макрофаги флуоресцентными репортерными зондами, содержащими группу связывания каспазы-1 и флуорофор, связанные через аминокислотную последовательность. Активированная каспаза-1 распознает аминокислотную последовательность зонда и связывается с его каспазосвязывающей группой, что позволяет визуализировать его.

Зафиксируйте клетки и покройте их флуоресцентным красителем, чтобы окрасить ядра. Изображение под флуоресцентным микроскопом.

Подсчет макрофагов с синими конденсированными ядрами и зелеными флуоресцентными очагами активированной каспазы-1, что позволяет предположить активацию инфламмасом NLRP3.

Начните с замены среды из макрофагов, полученных из костного мозга, полученных из ЛПС, засеянных на стеклянные покровные стекла, на 290 микролитров среды DMEM-5 с добавлением 5-микромолярного нигерицина и 5-миллимолярного глицина на лунку. Верните 24-луночный планшет в инкубатор для клеточных культур на 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, добавив 10 микролитров 30X FAM-YVAD-FMK через первые 15 минут.

В конце инкубации промыть клетки 1 миллилитром холодного PBS на лунку три раза в течение 5 минут на промывку и зафиксировать клетки 250 микролитрами 2% параформальдегида на лунку на 30 минут на льду, защищенном от света, пометив клетки соответствующим флуоресцентным ядерным красителем в течение последних пяти минут.

В конце инкубации трижды промойте ячейки холодной PBS, как показано только что, и загрузите на каждое стекло 7 микролитров монтажной среды, препятствующей выцветанию. Наденьте покровное стекло на каждое стекло и дайте монтажному материалу застыть в течение ночи, прежде чем запечатывать покровные стекла лаком для ногтей.

Чтобы получить изображение клеток с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии, поместите необработанное контрольное стекло на предметный столик микроскопа и вручную сфокусируйтесь на клетках. Используя настройки таблицы поиска микроскопа, отрегулируйте смещение до тех пор, пока в необработанных клетках не будет наблюдаться положительное положение зонда.

Затем, используя образец, обработанный нигерицином, найдите поле, содержащее клетки, которые являются как положительными, так и отрицательными для окрашивания зондом, и настройте плоскость визуализации канала зонда на плоскость с самой высокой интенсивностью положительного окрашивания. Затем отрегулируйте усиление до тех пор, пока в ячейках с конденсированными ядрами не станут видны очаги, и получите изображения пяти случайно выбранных полей на слайде при 100-кратном общем увеличении.