Введение бактериальных эффекторных белков в клетки млекопитающих методом электропорации

Некоторые грамотрицательные бактериальные патогены контактируют с клетками-хозяевами и используют системы секреции для введения эффекторных белков, облегчая вторжение в клетки.

Чтобы доставить эффекторные белки в клетки млекопитающих in vitro, пипетируйте клетки млекопитающих в охлажденную кювету. Добавьте бактериальные эффекторные белки, меченные стрептавидин-связывающим пептидом, и перемешайте.

Проводят электропорацию. Во время прогона короткие электрические импульсы разрушают липидный бислой мембраны клетки-хозяина, образуя переходные поры, облегчая клеточное проникновение эффекторных белков. Поместите клетки на стеклянную пластину, содержащую среду, что позволит клеткам восстановиться и прилипнуть к пластине. Поры снова запечатываются, захватывая белки внутри.

После восстановления клеток фиксируют и проникают в клетки для доступа антител к внутриклеточным мишеням. Инкубируйте с содержащим белок блокирующим раствором для предотвращения связывания неспецифических антител. Добавьте первичные антитела, которые специфически связываются со стрептавидин-связывающей пептидной меткой на внутриклеточных эффекторных белках.

Для визуализации введите меченные флуорофорами вторичные антитела