Модель инфекции слизистой оболочки шейки матки человека для изучения патогенеза ВИЧ в условиях ex vivo

Поместите слизистую оболочку шейки матки в чашку Петри. Отделите слизистую оболочку эктоцервикса и эндоцервикса от подслизистой. Нарежьте слой слизистой на более мелкие экспланты и перенесите их в коническую трубку.

Добавьте вирус иммунодефицита человека 1-го типа, или ВИЧ-1, в пробирку для экспланта. Частицы вируса ВИЧ-1 приближаются к обнаженному слою слизистой оболочки и связываются с рецептором CD4 и корецептором CXCR4 на клетке-хозяине.

После связывания вирусная оболочка сливается с мембраной клетки-хозяина, высвобождая вирусный капсид, содержащий вирусную РНК и фермент обратной транскриптазы, в цитоплазму. Внутри цитоплазмы обратная транскриптаза преобразует вирусную РНК в комплементарную ДНК, или кДНК.

КДНК перемещается в ядро клетки-хозяина, где интеграза встраивает вирусную ДНК в геном хозяина. Вирусная ДНК управляет синтезом новых вирусных РНК и белков, которые собираются в новые вирусные частицы. Эти частицы отпочковываются от клетки-хозяина, приобретая липидную оболочку.

Промойте экспланты подходящим буфером, чтобы удалить любой несвязанный вирус. Наконец, поместите экспланты на желатиновую губку в многолуночную пластину с подходящей средой и инкубируйте.

Интерфейс воздух-жидкость максимизирует воздействие кислорода и доступ питательных веществ через губчатые капилляры, повышая жизнеспособность модели для последующего анализа.

Используйте крышку чашки Петри в качестве режущей поверхности для рассечения ткани. Осторожно удерживая ткань щипцами, отделите слизистую оболочку эктоцервикса и/или эндоцервикса от нижней стромы и подслизистой оболочки с помощью скальпеля и лезвия, чтобы получить полоски слизистой оболочки. Нарежьте слизистую оболочку полосками шириной 2 миллиметра. Удалите и выбросьте как можно больше подслизистой оболочки, оставив только слой ткани толщиной 2 миллиметра. Затем нарежьте полоски на блоки толщиной 2 миллиметра.

Перенесите тканевые экспланты в новую 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую от 10 до 20 миллилитров ШМТ, чтобы избежать высыхания тканей во время вскрытия. В конце вскрытия поверните пластину, чтобы рандомизировать распределение экспланта. С помощью стерильных щипцов переложите экспланты в стерильные конические пробирки объемом 1,5 миллилитров. Удалите всю среду из пробирки с помощью пипетки.

Для достижения оптимальных результатов экспланты шейки матки должны быть обработаны и инфицированы как можно скорее после операции, в идеале в день операции. В качестве альтернативы ткани могут храниться в погружении в ШМТ при температуре 4 градуса в течение ночи и инфицироваться сразу после вскрытия.

Разморозьте препарат ВИЧ-1 на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. После размораживания перенесите вирус в трубки, содержащие экспланты. Переложите пробирки в термошейкер и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия, покачиваясь при 300 об/мин. Аккуратно переворачивайте трубки несколько раз каждые 30-60 минут.

Тем временем наполните шестилуночный планшет от 3 до 4 миллилитров стерильного фосфатно-солевого раствора. В конце инкубации с ВИЧ-1 с помощью пипетки выбросить весь вирусный препарат из пробирок, содержащих экспланты, в контейнер с дезинфицирующим раствором. Затем с помощью щипцов и пипетки перенесите экспланты в шестилуночный планшет, содержащий PBS.

Дав эксплантам отдохнуть в PBS в течение одной минуты при комнатной температуре, промойте их, осторожно пипетируя PBS вверх и вниз в лунку два-три раза. Затем слейте PBS в емкость с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Добавьте от 3 до 4 миллилитров нового PBS в каждую лунку. Повторите еще два раза, всего три стирки. Выбросьте PBS непосредственно перед переносом эксплантов на губки, чтобы избежать высыхания тканей.

Теперь с помощью щипцов перенесите пять-восемь эксплантов поверх каждой желатиновой губки в 12-луночную пластину. Верните тарелку в инкубатор.