Количественное определение биоактивных интерферонов I типа с использованием репортерного анализа секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы

0 views • 3:11 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для количественного определения биоактивных интерферонов I типа, таких как интерферон-альфа и интерферон-бета, в тестовом образце берут многолуночный планшет, содержащий сконструированные репортерные клетки. Эти клетки экспрессируют секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу, SEAP, репортерный ген под контролем интерферон-альфа и бета-индуцируемого промотора.

Добавьте тестовый образец, содержащий неизвестную концентрацию интерферона I типа. Пипетка с диапазоном концентраций интерферона I типа человека в другие лунки, которые действуют как стандартные контрольные приборы. Инкубировать.

Интерферон I типа в исследуемой лунке связывается со специфическим рецептором клеточной поверхности, активируя янус-киназы. Эти протеинкиназы фосфорилируют преобразователи сигнала и активаторы транскрипции, STAT, белки, которые димеризуются и образуют комплекс со специфическим регуляторным фактором интерферона.

Попадая в ядро, комплекс связывается со специфической последовательностью ДНК в индуцируемом интерферон-альфа и бета-индуцируемом промоторе, активируя транскрипцию гена SEAP и продуцируя ферменты SEAP, которые секретируются в среду.

Перенос среды, содержащей SEAP, в многолуночные лунки с подложкой, специфичной для SEAP. SEAP гидролизует розовый субстрат, получая продукт фиолетово-синего цвета.

С помощью считывателя микропланшетов измерьте абсорбцию продукта в тестовой и стандартной лунках, указывающую на уровни SEAP и концентрацию интерферона I типа.

По построенной стандартной кривой интерферона I типа определить концентрацию биоактивного интерферона I типа в исследуемом образце.

Чтобы измерить биоактивный интерферон I типа с использованием репортерных клеток интерферона-альфа/бета HEK-Blue, сначала наведите репортерные клетки с плотностью 50 000 клеток на лунку в 96-луночной пластине с плоским дном до конечного объема 180 микролитров. Затем добавьте по 20 микролитров только что собранной надосадочной жидкости в каждую лунку в двух экземплярах. Включите в комплект набор внутренних стандартных элементов управления и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 18–22 часов.

Чтобы определить уровни щелочной фосфатазы, высвобождаемой из репортерных клеток, добавьте по 180 микролитров раствора QUANTI-Blue в каждую лунку новой пластины с плоским дном. Затем добавьте 20 микролитров индуцированных надосадочных клеток интерферона-альфа/бета HEK-синего в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока в стандартных контрольных лунках интерферона не разовьется цвет.

Раствор QUANTI-Blue изменяется с розового на фиолетово-синий в присутствии фермента. Наконец, с помощью спектрофотометра можно оценить уровни секретируемой щелочной фосфатазы на глубине от 620 до 655 нанометров и определить концентрацию интерферона I типа путем экстраполяции линейной части стандартной кривой интерферона.

06:46

Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных

Related Videos

0 Views

06:09

Поколение незрелые, зрелые и толерогенную дендритных клеток с отличающимися метаболический фенотипов

Related Videos

0 Views

07:55

Макрофаг Репортер Ячейка Анализ для изучения Toll-как Рецептор-опосредованный NF-kB/AP-1 Сигнализация на Adsorbed белковых слоев на полимерных поверхностях

Related Videos

0 Views

09:13

Использование обратной генетики манипулировать АПЛ Ген Лихорадка Рифт-Валли Вирус MP-12 Штамм для повышения безопасности и эффективности вакцин

Related Videos

0 Views

13:41

Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека

Related Videos

0 Views

10:48

Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Related Videos

0 Views

08:04

Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации

Related Videos

0 Views

10:00

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Related Videos

0 Views

11:44

Высокое разрешение метод контроля Фосфорилирование-зависимая активация IRF3

Related Videos

0 Views

09:35

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Related Videos

0 Views

Last updated: 4 July 2026