$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Для количественного определения биоактивных интерферонов I типа, таких как интерферон-альфа и интерферон-бета, в тестовом образце берут многолуночный планшет, содержащий сконструированные репортерные клетки. Эти клетки экспрессируют секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу, SEAP, репортерный ген под контролем интерферон-альфа и бета-индуцируемого промотора.
Добавьте тестовый образец, содержащий неизвестную концентрацию интерферона I типа. Пипетка с диапазоном концентраций интерферона I типа человека в другие лунки, которые действуют как стандартные контрольные приборы. Инкубировать.
Интерферон I типа в исследуемой лунке связывается со специфическим рецептором клеточной поверхности, активируя янус-киназы. Эти протеинкиназы фосфорилируют преобразователи сигнала и активаторы транскрипции, STAT, белки, которые димеризуются и образуют комплекс со специфическим регуляторным фактором интерферона.
Попадая в ядро, комплекс связывается со специфической последовательностью ДНК в индуцируемом интерферон-альфа и бета-индуцируемом промоторе, активируя транскрипцию гена SEAP и продуцируя ферменты SEAP, которые секретируются в среду.
Перенос среды, содержащей SEAP, в многолуночные лунки с подложкой, специфичной для SEAP. SEAP гидролизует розовый субстрат, получая продукт фиолетово-синего цвета.
С помощью считывателя микропланшетов измерьте абсорбцию продукта в тестовой и стандартной лунках, указывающую на уровни SEAP и концентрацию интерферона I типа.
По построенной стандартной кривой интерферона I типа определить концентрацию биоактивного интерферона I типа в исследуемом образце.
Чтобы измерить биоактивный интерферон I типа с использованием репортерных клеток интерферона-альфа/бета HEK-Blue, сначала наведите репортерные клетки с плотностью 50 000 клеток на лунку в 96-луночной пластине с плоским дном до конечного объема 180 микролитров. Затем добавьте по 20 микролитров только что собранной надосадочной жидкости в каждую лунку в двух экземплярах. Включите в комплект набор внутренних стандартных элементов управления и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 18–22 часов.
Чтобы определить уровни щелочной фосфатазы, высвобождаемой из репортерных клеток, добавьте по 180 микролитров раствора QUANTI-Blue в каждую лунку новой пластины с плоским дном. Затем добавьте 20 микролитров индуцированных надосадочных клеток интерферона-альфа/бета HEK-синего в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока в стандартных контрольных лунках интерферона не разовьется цвет.
Раствор QUANTI-Blue изменяется с розового на фиолетово-синий в присутствии фермента. Наконец, с помощью спектрофотометра можно оценить уровни секретируемой щелочной фосфатазы на глубине от 620 до 655 нанометров и определить концентрацию интерферона I типа путем экстраполяции линейной части стандартной кривой интерферона.