Метод генерации вирусоподобных частиц гриппа с помощью системы млекопитающих

Вирусоподобные частицы, или VLP, имитируют структуру вируса, но не имеют вирусного генетического материала, что делает их невирулентными. VLP обладают поверхностно-связанными антигенными эпитопами, распознаваемыми иммунными клетками, что делает их идеальными кандидатами на вакцинацию.

Для получения рекомбинантных VLP гриппа берут эукариотические векторы экспрессии.

Два вектора содержат гены, кодирующие гемагглютинин, или ГК, и нейраминидазу, или НК — структурные белки вируса гриппа. Третий вектор содержит ген gag, кодирующий основные белки вируса иммунодефицита человека.

Добавьте реагент для трансфекции на основе катионных липидов. Положительно заряженная липидная головная группа взаимодействует с отрицательно заряженной ДНК, образуя бислой вокруг векторов, генерируя липосомные трансфекционные комплексы.

Добавляйте комплексы к культивируемым клеткам-хозяевам млекопитающих, пригодным для производства VLP, и инкубируйте. Трансфекционные комплексы проникают в клетки через эндоцитоз — мембрана липосомы сливается с мембраной эндосомы для высвобождения векторов в цитоплазму.

Векторы проникают в ядро, что приводит к экспрессии вирусных генов. При синтезе ГК и НК в эндоплазматическом ретикулуме белки транслоцируются к плазматической мембране по секреторному пути.

Основные белки синтезируются в цитоплазме и транспортируются к месту сборки для закрепления на плазматической мембране. Накопленные вирусные компоненты проходят самосборку в VLP и отпочковываются от клетки-хозяина.

Сбор высвобожденных VLP для последующей переработки.

В день трансфекции приготовьте растворы липосом и ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Трансфектируйте клетки ДНК с составом ДНК 1:1:2 HA:NA:Gag и общим количеством ДНК 40 мкг на колбу Т-150. Повторите этот шаг, чтобы создать девять колб Т-150 общим объемом 200 миллилитров.

Далее разведите растворы ДНК и липосом в бессывороточных трансфекционных средах без антибиотиков так, чтобы в каждой колбе содержался общий объем 24 миллилитров. Верните колбы в инкубатор и выдержите клетки в культуральной среде для трансфекции до дня сбора вирусоподобных частиц или VLP.

Перенесите надосадочную жидкость в конические пробирки объемом 15 миллилитров, чтобы собрать культуру из клеток через 72–96 часов после трансфекции. Вращайте клетки вниз, чтобы гранулировать клеточный мусор. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через пористую мембрану толщиной 0,22 микрона.