Генерация вирусоподобных частиц чикунгунья с использованием системы экспрессии бакуловируса в клетках насекомых

Вирусоподобные частицы чикунгунья, VLP, представляют собой неинфекционные структуры, состоящие из белков вирусной оболочки, встроенных в липидный бислой, и лишенных генетического материала.

Для получения Chikungunya VLP необходимо инфицировать клетки насекомых Spodoptera frugiperda Sf9 рекомбинантными бакуловирусами, экспрессирующими кассету структурных генов Chikungunya. Кассета состоит из промотора бакуловируса, слитого со структурными генами чикунгуньи, кодирующими капсид, и оболочечными белками.

Во время инкубации гликопротеины оболочки бакуловируса связываются с поверхностными рецепторами на клетках насекомых. Это облегчает проникновение бакуловируса и высвобождение вирусной ДНК в цитоплазму, генерируя полипротеины, содержащие капсид чикунгуньи и белки оболочки.

После синтеза при автокаталитическом расщеплении белка капсида образуется полипротеин-предшественник, обладающий оболочечными белками в эндоплазматическом ретикулуме, ER. В просвете ER ферменты расщепляют полипротеин-предшественник, генерируя отдельные белки, которые поступают в компартмент Гольджи для дальнейшей переработки, образуя белковые гетертримеры.

Резидентные протеазы Гольджи расщепляют белковые гетеротримеры, образуя зрелые оболочечные белки с белками Е2 и Е1. Эти белки оболочки перемещаются к мембране, превращаясь в VLP и высвобождаясь в среду.

Перенесите зараженную культуру в пробирку и центрифугу, чтобы гранулировать клетки насекомого. Отсадите VLP-содержащую надосадочную жидкость и отфильтруйте ее для удаления мусора.

Полученный фильтрат, содержащий чикунгунья VLP, готов к иммунопатологическим исследованиям.

Культуру предварительно готовят Spodoptera frugiperda, или клетки Sf9, в суспензии в колбах-спиннерах путем непрерывного перемешивания при 130 об/мин на многоточечной системе перемешивания пластин. Для правильной аэрации поддерживайте объемы культивирования на уровне не более половины объема колбы спиннера. Затем экспрессируйте CHIK VLP путем заражения 250 миллилитров клеток Sf9 в колбе спиннера с плотностью 2 х 10⁶ клеток на миллилитр предварительно приготовленным рекомбинантным бакуловирусом, и верните клетки в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия.

Используйте исключение трипанового синего, чтобы определить, снизилась ли жизнеспособность клеток до 70–80%. После подтверждения перенесите культуры непосредственно из суспензии в 50-миллилитровые конические пробирки, а клетки раскрутите вниз. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте их через пористую мембрану толщиной 0,22 микрона перед осаждением.