Прижизненная микроскопия для анализа взаимодействия клеток крови с эндотелием на мышиной модели с воспалением

Начните с мыши, находящейся под наркозом, которой внутрибрюшинно вводили липополисахарид, чтобы вызвать воспаление.

Надрез на животе обнажают брюшную полость. Поддерживайте увлажненность органов с помощью физиологического раствора. Введите родамин 6G ретроорбитально. Молекулы флуоресцентного красителя попадают в кровоток и помечают лейкоциты и тромбоциты для их визуализации.

Теперь вынесем наружу петлю подвздошной кишки с ее брыжеечными сосудами. Поддерживайте увлажненность ткани с помощью предварительно подогретого физиологического раствора для оптимальной визуализации. Под флуоресцентным микроскопом сфокусируйтесь на брыжеечной вене для прижизненной микроскопии.

Инъекция липополисахарида вызывает активацию эндотелиальных клеток с повышением регуляции молекул адгезии, в том числе селектинов. Циркулирующие тромбоциты рекрутируются в эндотелий, где они связываются посредством специфических адгезионных молекул-лигандных взаимодействий, образуя адгезионные комплексы.

Благодаря этим взаимодействиям тромбоциты активируются и высвобождают гранулы, содержащие молекулы, в том числе серотонин, способствуя пополнению лейкоцитов.

Лейкоциты перемещаются к поверхности эндотелия и связываются с активированными тромбоцитами. Далее лейкоциты катятся по эндотелию и связываются с эндотелиальными клетками посредством слабых адгезивных взаимодействий. Вращательное движение активирует лейкоцитарные интегрины для прочной адгезии к эндотелиальным клеткам, что имеет решающее значение для лейкоцитарно-эндотелиальной трансмиграции.

С помощью прижизненной микроскопии визуализируйте флуоресцентные лейкоциты и тромбоциты, чтобы определить их взаимодействие с эндотелиальными клетками в режиме реального времени.

За четыре часа до прижизненной визуализации введите 20 мг на килограмм LPS IP самцу мыши весом от 16 до 20 граммов в возрасте от 4 до 6 недель, чтобы вызвать имитацию бактериальной воспалительной реакции.

Предварительно подогрейте 0,9% солевой раствор на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия для увлажнения пластиковой камеры и брыжеечных тканей. Далее подтвердите подходящую глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги у мыши, обработанной ЛПС, а затем нанесите мазь на глаза животного.

Депилируйте живот с помощью бритвы, удаляя любые выпавшие волосы с помощью марли, пропитанной на 70% этанолом. Затем с помощью небольших изогнутых щипцов и ножниц откройте брюшную полость.

Определите эпигастральные сосуды и откройте брюшину в области белой линии, чтобы защитить сосуды. Нанесите несколько капель предварительно подогретого физиологического раствора в брюшную полость, чтобы сохранить ткань влажной, а затем сделайте ретроорбитальную инъекцию 50 микролитров родамина 6G для маркировки циркулирующих клеток крови. Затем поместите мышь в 10-сантиметровую чашку Петри, обработайте снаружи петлю подвздошной кишки и вводите предварительно подогретый физиологический раствор каждые две минуты, чтобы ткань оставалась влажной.

Чтобы визуализировать воспалительную реакцию с помощью прижизненной микроскопии, поместите мышь под микроскоп и поместите в поле зрения брыжеечную вену диаметром от 200 до 300 микрометров и как можно меньше видимого окружающего жира.

Используя соответствующее программное обеспечение для микроскопа, запишите взаимодействие клеток крови с эндотелием в течение 1 минуты в 4 различных венах каждой мыши. Затем, чтобы проанализировать межклеточные реакции, подтвердите стабильные и межиндивидуальные условия кровотока.

Чтобы количественно определить количество перекатывающихся лейкоцитов, проведите вертикальную линию через вену и вручную подсчитайте все лейкоциты, которые пересекают эту линию за 1 минуту. Чтобы определить скорость качения, проведите две вертикальные линии через вену на расстоянии 50 микрометров друг от друга и измерьте время, которое требуется одному лейкоциту, чтобы пересечь их между линиями при стабильном накате на эндотелии.

Чтобы измерить адгезию лейкоцитов, нарисуйте в вене квадрат размером 200 на 200 микрометров. Затем вручную подсчитайте плотно прикрепленные лейкоциты, которые не проявляют видимого движения в пределах квадрата в течение 30 секунд. Наконец, чтобы количественно оценить тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия, вручную подсчитайте количество тромбоцитов, связанных с одним лейкоцитом.