Методика создания модели бактериальной инфекции у личинок насекомых

Поместите личинку Galleria mellonella — большой восковой моли — на платформу для инъекций, обнажив брюшную сторону.

Возьмите микрошприц, содержащий суспензию Mycobacterium bovis BCG lux — живого бактериального вакцинного штамма, генетически модифицированного для получения биолюминесценции. Вводят суспензию в последнюю проногу, или брюшные придатки — выпускающие бактерии в гемолимфу — циркуляторную жидкость в полости тела.

Перенесите личинку в контролируемую среду и инкубируйте. Бактерии используют гемолимфу в качестве богатого источника питательных веществ и размножаются.

Гемоциты — иммунные клетки беспозвоночных в гемолимфе — группируются вокруг бактерий, образуя гранулемуподобную структуру для предотвращения распространения инфекции. Гемоциты высвобождают профенолоксидазу, которая подвергается протеолитическому расщеплению с образованием фенолоксидазы.

Фенолоксидаза синтезирует меланин, который изолирует бактерии в месте инфекции. Отложение пигмента меланина вызывает системную меланизацию, потемнение цвета личинок.

Гемоциты поглощают бактерии в фагосомы. Фагосомы сливаются с лизосомами для получения литических ферментов, вызывая бактериальную деградацию. Подмножество бактерий может уклоняться от фаголизосомальной деградации и находиться в гемоцитах, что приводит к персистирующей инфекции.

Измеряйте биолюминесценцию бактерий через определенные промежутки времени. Первоначальное снижение биолюминесценции указывает на эффективный антибактериальный ответ, в то время как плато этого значения указывает на персистирующую инфекцию.

Храните купленных личинок в темноте при температуре 18 градусов Цельсия по прибытии и используйте в течение одной недели после покупки. Выявляйте и отбирайте здоровых личинок для экспериментов на основе равномерного кремового цвета, соответствующего размера и веса, высокой подвижности и способности выпрямляться при переворачивании. С помощью пинцета с тупым концом тщательно пересчитайте здоровых личинок в чашку Петри, выстланную слоем фильтровальной бумаги, и храните при комнатной температуре в темноте до использования.

Подготовьте платформу для впрыска, прикрепив круглую фильтровальную бумагу диаметром 94 мм к плоской приподнятой поверхности. Отасуньте три объема 70% этанола в микрошприц объемом 25 микролитров для стерилизации, выбросьте и дополнительно промойте тремя объемами стерильного PBST. Затем повторно суспендируйте приготовленный инокулюм БЦЖ люкс, и аспирируйте 10 микролитров в стерилизованный микрошприц. Используйте отдельный шприц для аспирации PBST для отрицательного контроля.

После 10 инъекций повторно суспендируйте БЦЖ lux inoculum для обеспечения равномерной суспензии клеток. С помощью пинцета возьмите одну личинку и поместите ее на платформу для инъекций. На платформе переверните личинку на спину и обездвижите, закрепив голову и хвост пинцетом. Найдите последнюю левую ногу, отсчитывая вниз от головы личинки, и осторожно введите кончик иглы на глубину от 5 до 6 мм под углом от 10 до 20 градусов к горизонтальной плоскости. Введите инокулюм из шприца.

После каждого заражения перекладывайте зараженную личинку в чашку Петри, выстланную слоем фильтровальной бумаги. В одной 94-миллиметровой чашке Петри может разместиться до 30 личинок. Храните чашку Петри в вентилируемой темной коробке внутри инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.

Следите за выживаемостью личинок каждые 24 часа. Личинки считаются мертвыми, когда они не могут двигаться в ответ на прикосновение. Запишите выживаемость и оцените статистическую значимость с помощью теста Мантела-Кокса.