Измерение in vivo нагрузки бактерий, экспрессирующих люциферазу, в личинке насекомого

Чтобы измерить бактериальную нагрузку in vivo, начните со стерилизованных личинок насекомых, предварительно зараженных Bacillus Calmette-Guérin, или BCG lux. БЦЖ люкс — генетически модифицированный штамм БЦЖ Mycobacterium bovis, экспрессирующий люциферазу — фермент, продуцирующий биолюминесценцию.

Перенесите личинку насекомого в буферную пробирку лизирующей матрицы со стальными шариками. С помощью гомогенизатора гомогенизировать личинку, высвобождая внутриклеточные компоненты, в том числе бактерии, в буфер.

Центрифугируйте пробирку, чтобы собрать гомогенат и перенести его в трубку люминометра.

Промойте матричную трубку буфером, содержащим моющее средство, чтобы растворить клеточные фрагменты и выпустить остаточные бактерии.

Соедините фракции в одной пробирке люминометра и добавьте подложку люциферазы. Субстраты проникают в бактерии и взаимодействуют с ферментами люциферазы, в результате чего происходит биолюминесценция. Загрузите трубку в люминометр и измерьте биолюминесценцию.

Люминометр измеряет интенсивность излучаемого света и вычисляет относительную световую единицу, или RLU — показатель нагрузки БЦЖ in vivo на личинку насекомого.

Разбавьте разбавленную гомогенатную суспензию