Измерение in vivo нагрузки бактерий, экспрессирующих люциферазу, в личинке насекомого

Чтобы измерить бактериальную нагрузку in vivo, начните со стерилизованных личинок насекомых, предварительно зараженных Bacillus Calmette-Guérin, или BCG lux. БЦЖ люкс — генетически модифицированный штамм БЦЖ Mycobacterium bovis, экспрессирующий люциферазу — фермент, продуцирующий биолюминесценцию.

Перенесите личинку насекомого в буферную пробирку лизирующей матрицы со стальными шариками. С помощью гомогенизатора гомогенизировать личинку, высвобождая внутриклеточные компоненты, в том числе бактерии, в буфер.

Центрифугируйте пробирку, чтобы собрать гомогенат и перенести его в трубку люминометра.

Промойте матричную трубку буфером, содержащим моющее средство, чтобы растворить клеточные фрагменты и выпустить остаточные бактерии.

Соедините фракции в одной пробирке люминометра и добавьте подложку люциферазы. Субстраты проникают в бактерии и взаимодействуют с ферментами люциферазы, в результате чего происходит биолюминесценция. Загрузите трубку в люминометр и измерьте биолюминесценцию.

Люминометр измеряет интенсивность излучаемого света и вычисляет относительную световую единицу, или RLU — показатель нагрузки БЦЖ in vivo на личинку насекомого.

Разбавьте разбавленную гомогенатную суспензию на агаровой пластине, содержащей пиперациллин, и инкубируйте для выборочного выращивания БЦЖ в виде отдельных колоний. Колонии на пластине представляют собой колониеобразующую единицу, или КОЕ. Соотношение RLU/КОЕ коррелирует биолюминесценцию с жизнеспособностью бактерий.

Каждые 24 часа случайным образом отбирайте пять зараженных личинок и используйте ватную палочку, смоченную в 70% этаноле, для мягкой стерилизации личиночных поверхностей. Поместите личинки по отдельности в двухмиллилитровые лизирующие матричные пробирки, содержащие 800 микролитров стерильного PBS. Затем используйте гомогенизатор для гомогенизации личинок в течение 60 секунд со скоростью шесть метров в секунду.

Центрифугируйте пробирки для лизинга при 3500 умноженных на g в течение пяти секунд, чтобы удалить гомогенат из крышек, и осторожно сцедите гомогенат в пять стерильных люминометров по отдельности. Зарезервируйте 100 микролитров гомогената в стерильной реакционной пробирке объемом 1,5 миллилитра. Восстановите оставшийся гомогенат, промыв пробирки лизирующей матрицы одним миллилитром PBST, и дозируйте в соответствующие трубки люминометра.

Сделайте вихревые трубки люминометра и измерьте биолюминесценцию гомогенатов на люминометре. Затем готовят 10-кратные серийные разведения зарезервированных 100 микролитров гомогената в 24-луночных культуральных планшетах с использованием PBST. Нанесите пипеткой 10 микролитров разбавления на каждую агаровую пластину Middlebrook 7H11 и используйте разбрасыватель для стерильных пластин для распределения. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух недель.

После этого подсчитайте колониеобразующие единицы.