Мыши-мешочек для сбора липополисахарид-индуцированного воспалительного экссудата

Поместите мышь под наркозом на стерильную хирургическую прокладку, прикрепленную к дыхательному аппарату с непрерывным потоком кислорода и анестезирующего газа.

С помощью фильтра нагрузите шприц стерильным воздухом. Прикрепите иглу к шприцу и введите стерилизованный воздух подкожно в заднюю часть мыши, чтобы создать воздушный мешочек внутри слоев ткани. Следите за мышью до полного выздоровления.

Повторно обезболите мышь и введите липополисахарид (ЛПС) в воздушный мешочек. ЛПС связывается с толл-подобным рецептором 4, TLR-4 на тканевых резидентных макрофагах и дендритных клетках, активируя их.

Активированные клетки высвобождают различные медиаторы воспаления, такие как цитокины и хемокины, которые привлекают нейтрофилы и другие иммунные клетки. Эти медиаторы также увеличивают проницаемость близлежащих кровеносных сосудов, позволяя иммунным клеткам и растворимым факторам проникать в воздушный мешок из кровотока.

По мере накопления жидкости в мешочке образуется экссудат, состоящий из воспалительных клеток и различных биологически активных молекул.

Усыпьте мышь и введите в воздушный мешочек подходящий буфер для мытья. Соберите воспалительный экссудат в микроцентрифужную пробирку и центрифугу. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки в буфере для промывки.

Проанализируйте воспалительный экссудат для количественной оценки соотношения нейтрофилов и определения степени их инфильтрации.

После обезболивания мышей в нулевой день используйте фильтр 0,22 микрона, прикрепленный к пятимиллилитровому шприцу, чтобы получить трехмиллилитровый объем стерилизованного воздуха. Поднимите заднюю кожу мыши, находящейся под наркозом, с помощью пинцета и подкожно с помощью иглы размером 26 на 3/8 дюйма введите три миллилитра стерилизованного воздуха.

После обработки извлеките мышей из дыхательного аппарата и поместите их в хорошо оборудованную клетку. Следите за мышами, чтобы убедиться, что они живы, пока они не начнут двигаться. На третий день введите еще три миллилитра стерилизованного воздуха в ранее созданный воздушный карман для поддержания воздушного мешка.

На шестой день вводите в мешочек с воздухом различные методы лечения. Введите один миллилитр PBS в качестве отрицательного контроля и введите один миллилитр одного микрограмма на миллилитр LPS в качестве положительного контроля, чтобы вызвать местное воспаление. Через шесть часов принесите мышей в жертву.

В каждый воздушный мешочек введите один миллилитр буфера для промывки воздушного мешка и соберите воспалительный экссудат в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем дважды промойте воздушный мешочек двумя миллилитрами буфера для промывки, и соберите воспалительный экссудат в той же центрифужной пробирке.

Центрифугируйте при 100 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре промывочного буфера. Подсчитайте количество клеток для количественного определения соотношения нейтрофилов с помощью автоматического гематологического анализатора.