$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Чтобы количественно оценить инфильтрацию иммунных клеток в ткани мочевого пузыря мыши, инфицированной E. coli, поместите измельченную ткань в буфер для пищеварения, содержащий коллагеназу и дезоксирибонуклеазу.
Инкубируйте с регулярным встряхиванием, чтобы нарушить ткань.
Коллагеназа переваривает внеклеточный матрикс ткани, высвобождая клетки. Дезоксирибонуклеаза разрушает интерферирующую свободную ДНК.
После инкубации добавьте буфер с хелатирующим агентом и фетальную бычью сыворотку для инактивации пищеварительных ферментов.
Процедите переваренную смесь через ситечко, чтобы удалить остатки тканей и соединительной ткани, получив одноклеточную суспензию.
Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в буфере, содержащем Fc-блокирующие антитела. Эти антитела связываются с Fc-рецепторами иммунных клеток, предотвращая связывание неспецифических антител.
Добавьте меченые флуорофорами анти-CD45 антитела, которые связываются с трансмембранным белком CD45 на иммунных клетках.
Центрифугируйте и пропустите ресуспендированные клетки через сетчатое фильтр для удаления клеточных агрегатов.
С помощью проточного цитометра измерьте сигналы флуоресценции от флуорофор-конъюгированных антител на иммунных клетках, чтобы количественно оценить инфильтрацию иммунных клеток в мочевой пузырь.
Чтобы провести проточную цитометрию на ткани мочевого пузыря, после изоляции мочевого пузыря, как показано на рисунке, используйте ножницы, чтобы хорошо измельчить ткань. Добавьте 1 измельченный пузырь в каждую трубку, содержащую буфер для пищеварения, затем встряхните трубку, чтобы промыть измельченную ткань в буфере для пищеварения, и держите ее на льду, пока все пузыри не будут препарированы и измельчены. Инкубируйте измельченные пузыри при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60-75 минут, энергично встряхивая вручную в течение 5 секунд каждые 15 минут.
Когда ткань имеет стекловидный, прозрачный вид, напоминающий влажную папиросную бумагу, пищеварение завершено. Инактивируйте ферменты пищеварения, добавив от 2 до 3 миллилитров ледяного проточного цитометрического буфера, и аккуратно перемешайте. Затем поместите трубки на лед.
Чтобы обеспечить одноклеточную суспензию и удалить любую соединительную ткань, пропустите содержимое пробирки через 100-микрометровый фильтр, помещенный в 15-миллилитровую коническую трубку. Затем концом поршня шприца аккуратно продавите любую оставшуюся ткань через фильтр. Промойте фильтр еще 2 миллилитрами буфера для проточной цитометрии и держите образцы на льду. Затем промойте образцы центрифугированием при 200-кратном g при 4 градусах Цельсия в течение 7 минут.
Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера для проточной цитометрии, содержащего Fc-блок, разбавленного до 5 микрограммов на миллилитр, и переложите в 96-луночный планшет с круглым дном. Через 10 – 15 минут добавьте по 100 микролитров желаемого коктейля антител в каждый образец. Затем инкубируйте образцы на льду, защищенном от света, в течение 30-45 минут. Промойте образцы центрифугированием при 200 умноженных на г при 4 градусах Цельсия в течение 7 минут.
Наконец, ресуспендируйте клеточные гранулы в 200 микролитрах буфера для проточной цитометрии и пропустите образцы через клеточное сетчатое фильтр толщиной 40 микрометров на 5-миллилитровой полистирольной трубке непосредственно перед получением на проточном цитометре.