Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 2:49 мин. • July 8th, 2025
Начните с многолуночного планшета, содержащего мононуклеарные клетки периферической крови человека, или PBMC, полученные из вируса иммунодефицита человека или ВИЧ-инфицированного донора.
PBMC содержат различные иммунные клетки, в том числе ВИЧ-инфицированные CD4-положительные Т-клетки с интегрированной провирусной ДНК.
Засейте лунки смесью эритроцитов, паразитирующих на Plasmodium falciparum, или PfRBC, экспрессирующих антигены, полученные от паразитов, и неинфицированных эритроцитов.
Во время инкубации антигены PfRBC взаимодействуют с рецепторами иммунных клеток, активируя их и высвобождая цитокины.
Эти цитокины запускают нисходящую передачу сигналов в CD4 Т-клетках, инициируя транскрипцию провирусной ДНК ВИЧ и синтез новых вирусных РНК.
Вирусные РНК и белки ВИЧ образуют вирусные частицы, которые отпочковываются, заражая новые CD4 Т-клетки и распространяя ВИЧ-инфекцию.
Прогрессирующая ВИЧ-инфекция нарушает секрецию цитокинов, ухудшая иммунный ответ против PfRBC и приводя к персистирующей малярийной инфекции.
Со временем инфицированные эритроциты выделяют паразитов, которые вторгаются в новые эритроциты, размножая малярийных паразитов и создавая модель культуры клеток коинфекции малярии и ВИЧ.
Чтобы создать культуры коинфекции, начните с посева 1 x 106 свежевыделенных ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных PBMC в дозе 100 микролитров RPMI-S+ на лунку в 24-луночный планшет. Доведите общий объем каждой лунки до 500 микролитров с 400 микролитрами RPMI-S+.
Затем в трех экземплярах и в общем объеме 500 мкл на лунку добавить к ВИЧ-инфицированным и ВИЧ-неинфицированным клеткам 3 х 106 неинфицированных эритроцитов или 3 х10 6 паразитированных эритроцитов. Поместите планшет с коинфекцией в инкубатор для клеточных культур.
Затем, по прошествии соответствующего периода времени эксперимента, гранулируйте клетки и соберите по 700 микролитров надосадочной жидкости культуры из каждой лунки. Центрифугируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить любой мусор. Затем прикрепите образцы по мере необходимости; Пометьте пробирки и заморозьте их при температуре минус 20 градусов Цельсия или ниже для последующего анализа.