Визуализация внеклеточных ловушек в макрофагах из бронхоальвеолярных лаважных жидкостей человека

Во время инфекции альвеолярные макрофаги высвобождают макрофагальные внеклеточные ловушки или МЕТ для уничтожения патогенов.

МЕТ состоят из хроматиновых волокон в комплексе с пептидиларгининдеиминазами, ЗПА, матриксными металлопротеиназами и цитруллинированными гистонами.

Чтобы визуализировать МЕТ в макрофагах из жидкости бронхоальвеолярного лаважа, сначала центрифугируйте жидкость.

Поместите ресуспендированные элементы на покровные стекла в колодцы с несколькими лунками.

Макрофаги прикрепляются к покровным стеклам, в то время как другие клетки остаются во взвешенном состоянии и отбрасываются

от них.

Фиксируют макрофаги, сохраняя клеточную структуру. Проникайте в них для доступа к клеточным целям.

Добавьте блокирующие белки, препятствующие связыванию неспецифических антител.

Дополните первичным коктейлем антител, который связывается с целевыми цитруллинированными гистонами, ЗДА и матриксными металлопротеиназами соответственно.

Добавьте различные вторичные антитела, помеченные флуорофорами, которые связываются с первичными антителами-мишенями, связанными с белком MET.

Установите элементы с помощью монтажной среды, содержащей DAPI. DAPI, флуоресцентный краситель, окрашивает волокна хроматина.

С помощью конфокального микроскопа визуализируйте МЕТ, характеризующиеся флуоресцентными внеклеточными хроматиновыми волокнами с цитруллинированными гистонами, ЗПА и металлопротеиназами.

После получения макрофагов легких от человека и мышей с помощью бронхоальвеолярного лаважа, или БАЛ, согласно текстовому протоколу, используют трипановый синий и гемоцитометр для проведения подсчета жизнеспособных клеток на растворе БАЛ. Пипеткой от 1 до 4 х 10⁵ макрофагов в 500 мкл питательной среды на покровные стекла в лунках 24-луночных планшетов. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы клетки прилипли.

Удалите питательную среду и используйте PBS для промывки клеток один раз. Затем добавьте 2% параформальдегид/периодат/лизин или фиксатор PLP и инкубируйте образцы в течение 10 минут. После использования PBS для кратковременной промывки клеток добавьте 0,2% Tween-20 в PBS и инкубируйте клетки в течение 20 минут.

Далее, чтобы заблокировать клетки, добавьте 10% куриную сыворотку в 5% BSA, разведенную в PBS, и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем замените блочный раствор первичными и изотопными контрольными антителами в концентрации 1 к 100 и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации используйте PBS для промывания клеток перед добавлением соответствующих вторичных антител. Затем инкубируйте образцы в течение 40 минут при комнатной температуре.

После промывки ячеек в PBS смонтируйте образцы с помощью монтажной среды на основе DAPI. Затем визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа.