Рекомбинантная вирусная репортерная система in vitro для выявления вирусной инфекции

Возьмем, к примеру, культуру раковых клеток печени человека, генетически модифицированную для экспрессии таурохолата натрия, котранспортирующего полипептид или NTCP — трансмембранный рецептор.

Добавьте рекомбинантный вирус гепатита В, или HBV. Вирус состоит из внешней оболочки, содержащей поверхностные белки, и внутреннего нуклеокапсида, охватывающего геном. Вставка репортерного гена люциферазы подавляет репродуктивную способность вируса.

Белок вирусной оболочки связывается с рецептором NTCP клетки-хозяина.

NTCP взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста, EGFR, и олигомеризуется, индуцируя EGFR-опосредованный эндоцитоз вируса.

Вирусная оболочка сливается с эндосомной мембраной, высвобождая нуклеокапсид, который распадается в ядерном поровом комплексе.

Вирусный геном проникает в ядро и преобразуется в ковалентно замкнутую кольцевую ДНК или cccDNA — стабильную матрицу, кодирующую вирусные белки, в том числе люциферазу.

Через заданные промежутки времени собирайте клетки и лизируйте для высвобождения внутриклеточной люциферазы.

Введите репортерский субстрат. Люцифераза окисляет подложку, вырабатывая сигнал.

Постинфекционное повышение активности люциферазы указывает на непрерывную экспрессию вирусного генома.

Пластинчатые клетки HepG2, стабильно экспрессирующие таурохолат натрия, котранспортирующий полипептид или NTCP, восприимчивы к инфекции HBV и инкубируются при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

За сутки до заражения поместите примерно 5 x 10⁴ клеток HepG2/NTCP в лунки 96-луночного планшета, покрытого коллагеном, в 0,1 миллилитра питательной среды. Разморозьте рекомбинантный ВПЧ на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, пока во флаконе не не останется небольшое количество льда.

Подготовьте среду для инфекции, соединив 78 микролитров свежей питательной среды, два микролитра ДМСО, 10 микролитров 40% PEG8000 в 1X PBS и 10 микролитров рекомбинантного ВПЧ. Добавьте по 100 микролитров рекомбинантного раствора HBV в каждую лунку 96-луночного планшета.

Через день после заражения используйте 300 микролитров PBS для трех промывки клетки, чтобы удалить загрязняющий репортерный белок из вирусной фракции. Добавьте 200 микролитров питательной среды, содержащей 2% ДМСО, к инфицированным клеткам и инкубируйте в течение одной недели или меньше.

Чтобы провести анализ на инфекцию HBV, через неделю после заражения используйте PBS для промывания инфицированных клеток три раза. Добавьте к зараженным клеткам 50 микролитров буфера для лизиса. Покачивайте культуральную пластину в течение пяти минут, затем центрифугируйте при 2000 умноженных на g в течение пяти минут. Добавьте 50 микролитров репортерной подложки на люминометическую пластину, затем добавьте 20 микролитров клеточного лизата на пластину и перемешайте, кратковременно встряхивая. Наконец, поместите пластину в люминометр и начните считывание показаний.