Использование флуоресценции иммуно-РНК in situ для визуализации SARS-CoV-2

Возьмем, к примеру, фиксированные и проникнутые зараженные коронавирусом клетки Vero — линию клеток млекопитающих с дефицитом интерферона.

Внутри хозяина вирусная РНК присутствует в виде субгеномных или sgРНК, молекул РНК промежуточной длины, кодирующих специфические вирусные белки, синтезированные посредством транскрипции.

Добавьте зонды для гибридизационной цепной реакции или инициатора HCR.

Зонд HCR связывается со своей комплементарной последовательностью на целевой РНК.

Введите флуоресцентно меченные олигонуклеотидные зонды для шпилек, H-1 и H-2.

Инициирующий зонд связывается с его комплементарным хвостом H1, линеаризуя структуру шпильки.

Открытая последовательность H1 связывается со своим комплементарным хвостом H2.

Замыкающая последовательность H2 продолжает связываться с хвостом H1, усиливая флуоресцентные зонды вокруг целевой области и генерируя устойчивый сигнал.

Добавьте соответствующие антитела для визуализации цитоскелета клетки-хозяина.

Окрашиваем ядра с помощью DAPI.

Под флуоресцентным микроскопом инфицированные вирусом клетки демонстрируют красную флуоресценцию в цитоплазме, что указывает на наличие целевой РНК.

После фиксации и пермеабилизации клеток, как описано в текстовой рукописи, удалите из лунок 1x раствор PBS и добавьте в каждую лунку не менее 300 микролитров амплификационного буфера. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Подготовьте каждую шпильку HCR путем мгновенного охлаждения нужного объема в отдельных пробирках.

Для приготовления 300 микролитров раствора для амплификации используют по 18 пикамолей каждой шпильки. Перелейте раствор шпильки в пробирки, и инкубируйте их при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд. Затем остудите до комнатной температуры в течение 30 минут в темноте. Приготовьте смесь для шпилек, добавив охлажденные шпильками H1 и H2 в буфер для усиления. Капните от 30 до 50 микролитров смеси шпилек на парапленку и инкубируйте образцы в течение ночи в темноте при комнатной температуре.

Чтобы установить предметные стекла, поместите две капли монтажного материала объемом 10 микролитров на предметное стекло, убедившись, что капли отделены друг от друга достаточно, чтобы на одном предметном стекле можно было разместить два покровных стекла. Удалите лишнюю жидкость, постучав покровными стеклами по чистому полотенцу. Затем поместите их в монтажную среду с защитой от выцветания элементами вниз. Поместите смонтированные образцы на сухую плоскую поверхность в темноте и дайте им застыть.