Анализ для оценки влияния тестируемых соединений на проникновение вируса и его слияние в клетках-хозяевах

Возьмите раковые клетки печени и инкубируйте при низкой температуре, чтобы нарушить эндоцитоз.

Ввести рекомбинантный вирус гепатита С или ВГС, содержащий сконструированный геном РНК, кодирующий секретируемый репортер люциферазы.

Вирусные липопротеины взаимодействуют с протеогликанами на клетках хозяина, в то время как гликопротеины вирусной оболочки связываются со специфическими рецепторами хозяина.

В выбранные лунки добавьте тестируемое соединение, которое связывается с вирусными гликопротеинами.

При инкубации при физиологической температуре связанные вирусы эндоцитозируются.

Отбросьте неинтернализованные вирусы, добавьте питательную среду и инкубируйте.

В необработанных лунках гликопротеины способствуют слиянию вирусной оболочки и эндосомы, высвобождая нуклеокапсид, в то время как маскировка соединения ухудшает слияние в обработанных лунках.

При высвобождении РНК экспрессирует вирусные белки, в том числе люциферазу, которая секретируется внеклеточно.

Соберите люциферазосодержащую надосадочную жидкость и добавьте биолюминесцентный субстрат, который окисляется люциферазой для излучения света.

Снижение люминесценции в обработанных лунках по сравнению с необработанными указывает на ингибирование слияния вирусной оболочки с эндосомами.

Для анализа слияния и проникновения вируса предварительно охладите планшет для клеточной культуры при температуре 4 градуса Цельсия в течение одного часа после ночной инкубации для прикрепления клеток. Удалите имеющуюся среду из лунок, и заразьте клетки 10 ко второму ФОЕ HCV на льду.

Выдерживайте тарелку при температуре 4 градуса Цельсия в течение трех часов. Аккуратно промойте клетки дважды 200 микролитрами ледяного PBS, чтобы удалить неадгезивный вирус. Затем на льду обработайте клетки тестируемым соединением, растворенным в базальной среде или базальной средой с 1% ДМСО в качестве контроля, и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Это позволяет оценить тестируемые соединения по проникновению вируса, которое происходит при 37 градусах Цельсия.

Отсадите среду и дважды промойте неинтернализованные вирусы 200 микролитрами цитратного буфера или PBS. Добавьте 100 микролитров базальной среды в лунку и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия еще 72 часа. Соберите надосадочную жидкость и выполните анализ люциферазы Gaussia, как было показано ранее, для обнаружения высвобожденной люциферазы.